[發(fā)明專利]用于通用實(shí)時(shí)多重分析檢測(cè)的雙功能寡核苷酸探針

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201280055550.2
• 申請(qǐng)日: 2012-11-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103946397B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 京特·羅斯;貝恩德·法爾丁;費(fèi)利克斯·馮施特滕;西蒙·瓦德勒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 阿爾貝特-路德維希斯弗賴堡大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6818
• 分類號(hào): C12Q1/6818;C12Q1/6823;C12Q1/6876
• 代理公司: 北京銀龍知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11243
• 代理人: 金鮮英;張默

本發(fā)明涉及一種包括探針區(qū)域和介質(zhì)區(qū)域的介質(zhì)探針。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及一種包括介質(zhì)探針和檢測(cè)分子的系統(tǒng)，該系統(tǒng)的用途以及用于檢測(cè)至少一種靶分子的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種包括探針區(qū)域和介質(zhì)區(qū)域的介質(zhì)探針。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及一種包括介質(zhì)探針和檢測(cè)分子的系統(tǒng)、該系統(tǒng)的用途以及檢測(cè)至少一種靶分子的方法。

背景技術(shù)

現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)記載了樣品的分子生物學(xué)檢測(cè)和光學(xué)分析的大量研究方法。這些方法中的其中一種，是利用微陣列在少量生物樣品材料中進(jìn)行檢測(cè)或進(jìn)行幾千種單獨(dú)檢測(cè)的平行分析。微陣列有各種形式，有時(shí)也稱作“基因芯片”或生物芯片，類似于計(jì)算機(jī)芯片，其在非常小的空間內(nèi)包含了大量的信息。

微陣列使得能夠在通常為二維的基質(zhì)上對(duì)各種分析物進(jìn)行高度平行的檢測(cè)。微陣列的固定探針?lè)肿釉谏a(chǎn)過(guò)程中在適當(dāng)?shù)幕|(zhì)上，通過(guò)少量液體的轉(zhuǎn)運(yùn)而被固定和/或合成在柵格(陣列)上的確定位置(點(diǎn))。可以設(shè)計(jì)捕捉分子的這種二維、空間溶解的固定化，從而能夠檢測(cè)到核酸或肽和/或蛋白質(zhì)。作為規(guī)則，原位復(fù)制(lithography)方法僅允許短寡核苷酸和/或氨基酸鏈的合成。所生產(chǎn)的DNA微陣列可以在適當(dāng)?shù)臈l件下保存數(shù)月，但蛋白質(zhì)陣列僅能短時(shí)間保存。

對(duì)于微陣列分析，待分析樣品與合適的緩沖液混合并與相應(yīng)的微陣列一起孵育，于是，通常與互補(bǔ)序列片段發(fā)生雜交事件。基于微陣列系統(tǒng)的低敏感性，當(dāng)要檢測(cè)核酸(例如通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、RT-PCR或全基因組擴(kuò)增(WGA))的情況下，樣品在先前的反應(yīng)步驟中擴(kuò)增，并且被用于檢測(cè)的熒光染料標(biāo)記，或例如與微陣列上額外的檢測(cè)探針一起孵育。肽和蛋白質(zhì)不能酶促擴(kuò)增，通過(guò)樣品的純化而被濃縮用于分析。另一方面，還有一些方法，例如在成功雜交后通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)在微陣列上進(jìn)行信號(hào)擴(kuò)增。這種過(guò)程包括幾個(gè)耗時(shí)的步驟，并且提高了不準(zhǔn)確和污染的風(fēng)險(xiǎn)。通常的應(yīng)用方式包括表達(dá)分析以及病原體或抗性標(biāo)記的檢測(cè)中的微陣列。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在現(xiàn)有技術(shù)中能夠看到對(duì)各種合成技術(shù)和應(yīng)用的概覽。

在現(xiàn)有技術(shù)中，描述了擴(kuò)增的DNA片段在固定化的等位基因特異性寡核苷酸上的雜交，并且認(rèn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠獲得常規(guī)方法中的一種。在各種濃度下利用引物分子的前述的擴(kuò)增步驟使得能夠產(chǎn)生單鏈標(biāo)記的DNA，其優(yōu)選地與待產(chǎn)生的微陣列的捕捉分子相互作用。將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到微陣列后，可以在成功雜交后利用熒光或通過(guò)使用標(biāo)記生物素的引物直接進(jìn)行檢測(cè)，從而在雜交步驟以后接著進(jìn)行孵育，特別是與鏈酶親和素修飾的辣根過(guò)氧化物酶一起孵育，將可溶的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為不可溶的反應(yīng)產(chǎn)物。通過(guò)檢測(cè)顯色沉淀物，可以檢測(cè)靶分子與捕捉分子之間的結(jié)合事件。固定化引物的延長(zhǎng)反應(yīng)可選地在預(yù)先擴(kuò)增的靶序列的雜交之后進(jìn)行，其中結(jié)合了標(biāo)記生物素的核苷酸。在與鏈酶親和素修飾的堿性磷酸酶一起孵育以及在添加適當(dāng)?shù)幕|(zhì)后，可以通過(guò)形成顯色反應(yīng)產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)靶序列的存在。

在另一實(shí)施方式(基于多重定量DNA陣列的PCR、MQDA-PCR)中，待檢測(cè)的核酸首先與雙功能引物平行地?cái)U(kuò)增，進(jìn)行幾個(gè)PCR循環(huán)。這會(huì)產(chǎn)生具有通用5’端的擴(kuò)增產(chǎn)物，使得接下來(lái)能夠進(jìn)行與通用引物的競(jìng)爭(zhēng)性準(zhǔn)單倍體(quasi-monoplex)擴(kuò)增。接著，在分離步驟中，靶序列特異性的探針通過(guò)添加修飾的核苷酸而被標(biāo)記并且在微陣列上雜交。通過(guò)使用雙功能引物，可以進(jìn)行多重等級(jí)提高的兩步PCR反應(yīng)，并且不同序列不會(huì)對(duì)反應(yīng)效率帶來(lái)顯著影響。這種復(fù)雜的程序方案對(duì)于整合成為工作程序具有消極影響。重復(fù)添加和除去反應(yīng)物和/或反應(yīng)產(chǎn)物并且在多容器之間轉(zhuǎn)移反應(yīng)批次物，會(huì)導(dǎo)致大量的手動(dòng)工作量(“動(dòng)手時(shí)間(hands-on time)”)、長(zhǎng)等待時(shí)間(“等待結(jié)果的時(shí)間”)以及程序錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)。除了準(zhǔn)備單個(gè)PCR反應(yīng)批次物之外，程序包括多個(gè)孵育步驟，其中將雙功能引物消解，例如探針被標(biāo)記并且在微陣列上孵育。這導(dǎo)致待測(cè)靶序列與芯片表面上的固定化的捕捉分子之間的直接關(guān)聯(lián)。因此，這種方法不適于在不產(chǎn)生新的微陣列的情況下區(qū)分靶序列。這些方法的另一缺點(diǎn)是擴(kuò)增以后必須將樣品材料在兩個(gè)反應(yīng)器皿之間轉(zhuǎn)移，而在這個(gè)過(guò)程中可能產(chǎn)生程序錯(cuò)誤和污染。