[發明專利]酵母中生產古細菌蛋白酶的方法

無效

• 申請號: 201280054844.3
• 申請日: 2012-11-05
• 公開（公告）號: CN103930544A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 松井知子
• 申請（專利權）人: 諾維信公司
• 主分類號: C12N9/52
• 分類號: C12N9/52;C12N15/62;C12N15/81
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 龍淳;顧小曼

對序列表的引用

本申請包含計算機可讀形式的序列表。該計算機可讀形式并入本文以作參考。

技術領域

本發明涉及通過表達融合蛋白在酵母中微生物生產蛋白酶多肽。下面例舉的生產為源自古細菌激烈火球菌(Pyrococcus?furiosus)的蛋白酶。

背景技術

目前以多種方式工業化生產蛋白或多肽，所有這些均涉及生產蛋白的微生物的培養。優化工業蛋白產量的數種方法在本領域中是熟知的并且正被常規地利用，諸如操縱生長培養基、改造微生物例如通過影響期望蛋白的編碼基因的表達的對遺傳元件如啟動子和信號序列等的突變、變異，以及操縱基因本身，以便例如增強蛋白穩定性或活性。

先前已描述了融合蛋白作為生產其他方式難以獲得的蛋白的一種方式，一個實例可以是活性人抗體(Goshorn,S.C.等人,Cancer?Research,1993,Vol.53(9)pp.2123-2127)或在芽孢桿菌屬宿主中生產工業酶(WO00/75344)。

發明內容

來自極端微生物的酶常常具有工業應用感興趣的性質，例如，非常高的熱穩定性。然而，它們可能難以以工業相關的量并以活性形式生產。

本發明人發現，來源于古細菌激烈火球菌的蛋白酶難以在面包酵母(baker’s?yeast)、釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)中表達，即使是從設計用于在酵母中和分泌信號(該分泌信號通常在酵母中良好運作)一起表達的合成基因中表達時也是如此(參見實施例1)。

然而，令人驚奇地發現，當古細菌蛋白酶與三個不同的異源真菌分泌的載體蛋白之中任一者翻譯融合而表達時，蛋白酶可以以其成熟和活性形式由釀酒酵母生產和分泌(參見實施例2)。

因此，在第一方面，本發明涉及在酵母中生產蛋白酶的方法，包括：

(a)提供包括至少一個多核苷酸表達構建體的酵母宿主細胞，該多核苷酸表達構建體編碼與第二多肽翻譯融合的由該宿主細胞分泌的第一多肽，其中該第二多肽選自：

(i)其成熟部分與SEQ?ID?NO:2的成熟多肽；優選與SEQ?ID?NO:2的位置[1-412](包含兩端)具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％氨基酸序列同一性的蛋白酶；

(ii)其成熟部分由與SEQ?ID?NO:1的成熟多肽編碼序列；優選與SEQ?ID?NO:1的位置[397-1632](包含兩端)具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％DNA序列同一性的多核苷酸所編碼的蛋白酶；

(iii)其成熟部分由在低等嚴格條件、中等嚴格條件、中高等嚴格條件、高等嚴格條件或極高等嚴格條件下與SEQ?ID?NO:1的成熟多肽編碼序列；優選與SEQ?ID?NO:1的位置[397-1632](包含兩端)；或兩者中任一者的全長互補物雜交的多核苷酸所編碼的蛋白酶；

(iv)SEQ?ID?NO:2的成熟多肽、優選SEQ?ID?NO:2的位置[1-412](包含兩端)的變體，其包括在一個或多個位置上的取代、缺失和/或插入；和

(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)多肽的具有蛋白酶活性的片段，

(b)在有益于該第一多肽的表達和分泌的條件下培養宿主細胞，由此分泌翻譯融合多肽并生產成熟蛋白酶；和

(c)任選地，回收蛋白酶。

在第二方面，本發明涉及如第一方面的步驟(a)中所限定的酵母宿主細胞。

在最后一個方面，本發明涉及如第一方面的步驟(a)中所限定的多核苷酸表達構建體。

具體實施方式

定義