[發明專利]酵母中生產古細菌蛋白酶的方法

無效

• 申請號: 201280054844.3
• 申請日: 2012-11-05
• 公開（公告）號: CN103930544A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 松井知子
• 申請（專利權）人: 諾維信公司
• 主分類號: C12N9/52
• 分類號: C12N9/52;C12N15/62;C12N15/81
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 龍淳;顧小曼

1.一種在酵母中生產蛋白酶的方法，包括：

(a)提供包括至少一個多核苷酸表達構建體的酵母宿主細胞，所述多核苷酸表達構建體編碼與第二多肽翻譯融合的由所述宿主細胞分泌的第一多肽，其中所述第二多肽選自：

(i)其成熟部分與SEQ?ID?NO:2的成熟多肽；優選與SEQ?ID?NO:2的位置[1-412]具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％氨基酸序列同一性的蛋白酶；

(ii)其成熟部分由與SEQ?ID?NO:1的成熟多肽編碼序列；優選與SEQ?ID?NO:1的位置[397-1632]具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％DNA序列同一性的多核苷酸所編碼的蛋白酶；

(iii)其成熟部分由在低等嚴格條件、中等嚴格條件、中高等嚴格條件、高等嚴格條件或極高等嚴格條件下與SEQ?ID?NO:1的成熟多肽編碼序列；優選與SEQ?ID?NO:1的位置[397-1632]；或兩者中任一者的全長互補物雜交的多核苷酸所編碼的蛋白酶；

(iv)SEQ?ID?NO:2的成熟多肽、優選SEQ?ID?NO:2的位置[1-412]的變體，其包括在一個或多個位置上的取代、缺失和/或插入；和

(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)多肽的具有蛋白酶活性的片段，

(b)在有益于所述第一多肽的表達和分泌的條件下培養所述宿主細胞，由此分泌翻譯融合多肽并生產成熟蛋白酶；和

(c)任選地，回收蛋白酶。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述酵母是酵母屬，優選為釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述第一多肽是全長的或C端截短的天然或異源的酶；優選為水解酶、異構酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶或轉移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶。

4.根據權利要求3所述的方法，其中所述第一多肽是全長的或C端截短的天然或異源的葡糖淀粉酶；優選為選自以下的全長的或C端截短的天然或異源的葡糖淀粉酶多肽：

(a)與SEQ?ID?NO:6的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；

(b)由在低等嚴格條件、中等嚴格條件、中高等嚴格條件、高等嚴格條件或極高等嚴格條件下與(i)SEQ?ID?NO:5的成熟多肽cDNA編碼序列，(ii)于2009年11月23日保藏于德意志微生物和細胞培養物保藏中心(DSMZ)且分配登錄號為DSM23123的大腸桿菌菌株中的質粒AMG1中所插入的AMG基因，或(iii)(i)或(ii)的全長互補物雜交的多核苷酸所編碼的多肽；和

(c)由與SEQ?ID?NO:5的成熟多肽編碼序列或與于2009年11月23日保藏于德意志微生物和細胞培養物保藏中心(DSMZ)且分配登錄號為DSM23123的大腸桿菌菌株中的質粒AMG1中所插入的AMG基因的成熟多肽編碼序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多核苷酸編碼的多肽。