[發(fā)明專利]制備用于藥物遞送的脂質(zhì)納米顆粒的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201280054027.8
• 申請(qǐng)日: 2012-11-02
• 公開（公告）號(hào): CN103906504B
• 公開（公告）日: 2017-11-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: V·克諾波夫;R·P·維特;P·卡爾瑪里;R·李;D·韋布;V·阿科皮揚(yáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 日東電工株式會(huì)社
• 主分類號(hào): A61K9/127
• 分類號(hào): A61K9/127;C12N15/113
• 代理公司: 永新專利商標(biāo)代理有限公司72002
• 代理人: 過曉東

相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求2011年11月4日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/556,124 號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其整體援引加入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本文涉及一種簡單且可重復(fù)地形成脂質(zhì)-核酸顆粒的方法。所述方法產(chǎn)生平均大小為50-150nm的單分散的顆粒。

背景技術(shù)

脂質(zhì)可以用作載體用于遞送治療分子，特別是用于遞送核酸。脂質(zhì)形成脂質(zhì)體，其可以包裹、絡(luò)合或包埋核酸分子，從而在給藥(例如靜脈內(nèi)給藥至循環(huán))時(shí)增加遞送這類治療分子至靶細(xì)胞。它們在藥物組合物中的有用性受到可用于可重復(fù)地制備脂質(zhì)-核酸納米顆粒的方法的限制。已設(shè)計(jì)各種方法以制備這類納米顆粒。

Batzri et al.,1973,Biophys Biochem Acta298:1015-19和Kremer et al., 1977,Biochemistry16:3932-35描述了通過將脂質(zhì)溶于乙醇并將該乙醇溶液注射入水溶液來制備脂質(zhì)囊泡，其中脂質(zhì)自發(fā)地形成脂質(zhì)體。Hirota et al., 1999,BioTechniques27:286-89描述了通過將陽離子脂質(zhì)溶于乙醇并將該乙醇溶液注射入包含核酸分子的水溶液來制備包被核酸分子的脂質(zhì)囊泡。這種方法不能制備包裹核酸的脂質(zhì)體。

Maurer et al.US7094423描述了通過首先制備水溶液中的預(yù)制單層脂質(zhì)囊泡來制備包裹核酸的脂質(zhì)體。通過將脂質(zhì)溶于乙醇并將該脂質(zhì)混合物注射入水性緩沖液來制備預(yù)制脂質(zhì)囊泡。制備空的預(yù)制囊泡的過程包括通過擠出分選大小。分選大小之后將乙醇添加至空的預(yù)制囊泡以使它們不穩(wěn)定，并且將40％乙醇中的核酸添加至不穩(wěn)定的脂質(zhì)囊泡。溫育之后，將該混合物滲濾以去除乙醇。乙醇百分比、溫度、溫育時(shí)間、脂質(zhì)組成、藥物/ 脂質(zhì)比例和初始核酸濃度的變化均影響這種方法的包裹效率和收率。例如， Maurer等人證實(shí)包埋隨著寡核苷酸:脂質(zhì)比例的增加而增加，在超過0.16mg 反義寡核苷酸/mg脂質(zhì)時(shí)達(dá)到最大，同時(shí)產(chǎn)生較大脂質(zhì)體的數(shù)量和它們的多分散性的增加。

Semple et al.US6858225利用可電離的陽離子脂質(zhì)制備包裹RNA的脂質(zhì)體。將脂質(zhì)溶于乙醇并與低pH的水性緩沖液中的核酸組合。去除乙醇并將pH調(diào)至中性pH以形成脂質(zhì)體。所得的脂質(zhì)體是異質(zhì)的，需要?jiǎng)驖{或擠出以獲得單分散脂質(zhì)囊泡。與Maurer等人一致，Semple等人證實(shí)包埋隨著寡核苷酸:脂質(zhì)比例的增加而增加，在超過0.16mg反義寡核苷酸/mg脂質(zhì)時(shí)達(dá)到最大，同時(shí)產(chǎn)生較大脂質(zhì)體的數(shù)量和它們的多分散性的增加。

MacLachlan et al.US7901708描述了通過在混合室(T-管)中混合溶于乙醇的脂質(zhì)與水溶液中的RNA來制備包裹RNA的脂質(zhì)囊泡，其中將脂質(zhì)和 RNA逐步稀釋，從而基本上立即形成囊泡。

Wheeler et al.US20100041152描述了制備包裹RNA的脂質(zhì)體，將陽離子脂質(zhì)溶于乙醇并與65-85％乙醇中的RNA混合以產(chǎn)生可溶的電荷中和的復(fù)合物，將非陽離子脂質(zhì)添加至這個(gè)復(fù)合物以形成脂質(zhì)-核酸混合物并去除乙醇。脂質(zhì)體需要?jiǎng)驖{或擠出以獲得單分散脂質(zhì)囊泡。

對(duì)包裹核酸而不需要廣泛的機(jī)械加工步驟以制備預(yù)制脂質(zhì)體且不需要加工步驟將脂質(zhì)-核酸顆粒減少為單分散群體的制備方法仍有相當(dāng)?shù)男枨蟆?/p>

發(fā)明內(nèi)容

本文的一方面是一種制備包裹聚陰離子的脂質(zhì)納米顆粒的方法，所述方法包括以下步驟：以恒定速率將包含溶于與水混溶的有機(jī)溶劑的脂質(zhì)的第一溶液添加至包含水性緩沖液中的聚陰離子的第二溶液，同時(shí)攪拌所述第二溶液以制備包含25-45％(v:v)的所述有機(jī)溶劑的混合物；以及通過相對(duì)于中性pH的水性緩沖溶液進(jìn)行滲濾來從所述混合物去除所述有機(jī)溶劑。將所述第一溶液添加至所述第二溶液優(yōu)選在1-100分鐘內(nèi)完成。所述聚陰離子可以為核酸，例如RNA分子。所述聚陰離子優(yōu)選的濃度為0.08-0.8mg/ml。所述脂質(zhì)納米顆粒的藥物:脂質(zhì)比例(w:w)優(yōu)選為0.06-0.16。所述脂質(zhì)納米顆粒的藥物:脂質(zhì)電荷比例為1:25:1-1:1。

所述方法的另一實(shí)施方案為使用水溶液中的多糖。所述多糖優(yōu)選自蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、乳糖、麥芽糖和菊粉。所述方法的另一實(shí)施方案還包括冷凍干燥所述包裹聚陰離子的脂質(zhì)納米顆粒的步驟。

在所述方法的另一實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶液優(yōu)選為乙醇。優(yōu)選地，在完成所述脂質(zhì)和所述聚陰離子的混合物時(shí)，所述混合物包含35％(v:v)的乙醇。