[發明專利]病毒基因表達的抑制

無效

• 申請號: 201280053081.0
• 申請日: 2012-10-26
• 公開（公告）號: CN104011209A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 帕特里克·阿巴思諾特;賈斯廷·希恩;阿布杜拉·伊利;穆薩·馬里亞尼;約蘭塔·布瑞恩斯卡;詹尼弗·多諾費奧;馬克西米利安C.R.·布夫;約阿希姆W.·恩格斯;斯蒂芬·貝恩哈特
• 申請（專利權）人: 約翰內斯堡威特沃特斯蘭德大學;歌德大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A61K31/712;A61P31/20
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 吳泳歷

引言

本發明涉及通過RNA干擾途徑調節基因表達的修飾的小干擾RNA分子(siRNA)。編碼本發明所述siRNA的核酸分子包括能使它們的物理性質與野生型未修飾的siRNA相比產生差別的一個或多個修飾。在本發明一個優選的實施例中，所述siRNA的核酸序列包括至少一個具有2-O-胍基丙基(GP)結構的核苷。在本發明的進一步的實施例中，所述siRNA的修飾提高了該修飾的siRNA的穩定性，促進該修飾的siRNA導致的基因沉默并減少免疫刺激。

背景技術

合成的RNA干擾(RNAi)激活劑顯示出在病理基因沉默的治療應用方面有著相當大的潛力。一些典型的外源RNA干擾激活劑包括約21bp的在3′末端具擁有2個堿基懸垂的雙鏈RNA。為了提高siRNAs的效果，在核糖的2′-OH基團進行化學修飾。使用這種方法已經證明可提高穩定性，促進基因沉默和減少免疫刺激。盡管這種方法有一定的作用，高效并可控的高負電荷核酸基因沉默子仍然是一個有待解決的問題。

為了評估在2`位置引入正電荷基團的潛在實用性，我們主要對包含2-O-胍基丙基(GP)結構的新型siRNA的效果評估進行了研究。我們描述了所有四種用丙烯腈進行利用邁克爾加成反應然后進行雷尼鎳還原并胍基丙基化的GP修飾的核苷。所使用的這些前體成功地生成抗肝炎B病毒(HBV)siRNA。在病毒復制的細胞培養模式中的實驗表明所述GP修飾促進強化了基因沉默。此外，所述GP結構并不影響熱力學穩定性，并且在siRNA的種子區域的每個位點導入GP結構并不改變預定HBV靶標的沉默效率。這些結果表明采用GP基團修飾的siRNA在推進合成的RNA干擾激活劑的治療應用可能起到了一定的作用。

使用合成的小干擾RNA(siRNA)來啟動RNA干擾(RNAi)介導的基因沉默在治療應用上具有相當大的潛力[1],[2],[3]。典型地，siRNA為天然Dicer酶產物的合成模擬物，并且為在3`末端具有2個堿基懸垂的21-25個核苷酸(nt)雙鏈。使用合成siRNA的進展得益于研究反義RNA分子的豐富經驗。因此，加速了使用合成siRNA的發展并且siRNA效率的提高得以于有價值的生物的和合成化學的見解。合成的siRNA相比表達的RNA干擾激活劑的優勢在于他們可修改的化學修飾以提高穩定性、安全性和特異性[4],[5]。并且，利用化學合成程序可以實現臨床應用所需的可控的大規模制備。然而，盡管具有如此顯著的進步，這些聚陰離子的核酸穿過富含脂質的細胞膜的轉運仍然是有問題的。用于運載合成RNA干擾激活劑至靶標細胞的載體包括包含脂質復合物的陽離子脂質[6]，共軛肽[7]或寡聚陽離子復合物，例如亞精胺[8]。然而，使用這些方法不一定都能成功。為了克服核酸的過多負電荷的困難，并同時提高熱穩定性和血清穩定性，我們前期研究了一種利用陽離子基團進行核糖2`限定修飾的方法[9],[10]。最初，我們經常得到2′-O-氨乙基-腺苷和2′-O-氨乙基-尿苷。合成限定初始步驟為用溴乙酸甲酯進行的烷化，然后緊接一系列的轉化反應。利用熒光素酶報告基因分析來測定基因抑制，結果表明，2′-O-氨乙基修飾至少對2′-OMe?siRNA修飾是有效的。2′-O-氨乙基衍生物的一個重要特性是當化學修飾發生在siRNA隨從鏈的3`端時它能夠援救活性較低的siRNA[11]。這種途徑隨后通過開發能夠成功對所有四種核糖核苷進行烷化的方法得以改進[12]。這通過利用酞酰亞氨甲基三氟甲烷磺酸作為烷化劑并利用可以形成所有四種承載2′-O-氨乙基支鏈的亞磷酰胺的方法已經實現。雖然令人鼓舞，但利用這些siRNA試劑的一個問題在于多步化學合成的產率相當低。此外，擴大合成反應也很困難。

為了解決這些問題，我們已經研究了一種替代的2-O-胍基丙基(GP)核苷修飾的實用方法。采用此處報道的該新方法，我們描述了利用丙烯腈進行邁克爾加成反應[13,14,15]然后進行雷尼鎳還原[16]并胍基丙基化獲得的所有四種GP修飾的核苷的結構。在B型肝炎病毒復制的細胞培養模型中利用之前顯示適合基于RNA干擾的病毒復制抑制的靶標序列對GP?siRNA的效率進行評估[17,18,19,20]。結果表明，相比未修飾的對應部分病毒復制標記顯示出更高效的沉默。此外，所述GP修飾的siRNA在血清條件下比未修飾的對照更穩定。

發明內容

本發明提供了修飾的核酸分子和包含所述修飾的核酸分子的制品。