[發明專利]性能增強和溫度抗性蛋白酶變體

在審

• 申請號: 201280052803.0
• 申請日: 2012-10-19
• 公開（公告）號: CN103906836A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: H·赫爾穆特;M·默克爾;B·勞夫斯;S·威蘭;T·奧康奈爾;S·通德拉;T·韋伯
• 申請（專利權）人: 漢高股份有限及兩合公司
• 主分類號: C12N9/54
• 分類號: C12N9/54
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 王健

本發明是酶技術領域。本發明特別涉及蛋白酶及其制備，其氨基酸序列已經修飾，特別是針對洗滌劑和清洗劑的用途；涉及所有具有相應修飾的足夠類似的蛋白酶；以及涉及編碼它們的氨基酸。本發明還涉及這些蛋白酶的方法和用途以及涉及試劑，特別是含有它們的洗滌劑和清洗劑。

蛋白酶屬于所有酶中技術上最重要的。對于洗滌劑和清洗劑，它們是建立最久的酶，特別是含在所有現代高性能洗滌劑和清洗劑中。它們引起要清洗的材料上含蛋白污跡的分解。繼而在這些之中，枯草桿菌蛋白酶類型(枯草桿菌酶(subtilases)、枯草桿菌肽酶，EC3.4.21.62)的蛋白酶是特別重要的，其由于催化有效的氨基酸而被分類為絲氨酸蛋白酶。它們作為非特異性內肽酶，水解位于肽或蛋白內的任何酰胺鍵。它們的最佳pH通常在顯著的堿性范圍。已有此家族的綜述，例如，R.Bott和C.Betzel編輯的Subtilisin?enzymespp.75-95中R.Siezen的文章Subtilases:subtilisin-like?proteases,New?York,1996。枯草桿菌酶由微生物自然形成；其中，要特別提到的枯草桿菌酶中最重要的組是由芽孢桿菌(Bacillus)物種形成和分泌的枯草桿菌蛋白酶。

偏好用于洗滌劑和清洗劑中的枯草桿菌蛋白酶類型蛋白酶的實例是枯草桿菌蛋白酶BPN'和Carlsberg，蛋白酶PB92，枯草桿菌蛋白酶147和309，來自遲緩芽孢桿菌(Bacillus?lentus)特別是來自遲緩芽孢桿菌DSM5483的蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶DY以及如下酶(然而，清楚起見，嚴格意義上是枯草桿菌酶而不再是枯草桿菌蛋白酶)：熱酶(thermitase)、蛋白酶K、蛋白酶TW3及TW7、以及與初始蛋白酶相比包含修飾的氨基酸序列的前述蛋白酶的變體。蛋白酶可以使用本領域已知的方法以可控或隨機方式被修飾，并由此被優化，例如用于洗滌劑和清洗劑。這些包括點誘變、缺失或插入誘變、或與其他蛋白或蛋白部分融合。現有技術中已知的大部分蛋白酶的相應優化變體因而是已知的。

國際專利申請WO95/23221和WO92/21760公開了適宜用于洗滌劑或清洗劑的來自遲緩芽孢桿菌DSM5483的堿性蛋白酶的變體。國際專利申請WO2011/032988進一步公開了同樣含有來自遲緩芽孢桿菌DSM5483的堿性蛋白酶的變體的洗滌劑和清洗劑。這些文件中公開的蛋白酶變體可于來自遲緩芽孢桿菌DSM5483的堿性蛋白酶計數位置的3、4、99和199處(在另外的位置之外)被修飾，并且可在前述位置處包含例如氨基酸3T、4I、99D、99E或199I。然而，如下文所述的這些修飾的組合在這些文件中卻并未提到。

現在令人吃驚地發現，包含若干個這些修飾的組合的來自遲緩芽孢桿菌DSM5483的堿性蛋白酶類型的蛋白酶或者與其足夠類似的蛋白酶(基于序列相同性)特別適宜用于洗滌劑或清洗劑中并且特別有利于洗滌性能和/或穩定性的改善。

本發明的主題是蛋白酶，其包含在全長上與SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列，并且包含根據SEQ?ID?NO.1計數的氨基酸取代R99E或R99D與選自S3T、V4I和V199I的至少兩個另外氨基酸取代的組合。

本發明的另一主題是制備蛋白酶的方法，包括向在全長上與SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列至少70％相同的起始蛋白酶中引入根據SEQ?ID?NO.1計數的氨基酸取代R99E或R99D與選自S3T、V4I和V199I的至少兩個另外氨基酸取代的組合。

因此，用于本專利申請目的的蛋白酶既涵蓋了前述的蛋白酶也涵蓋了根據本發明方法制備的蛋白酶。因而所有涉及蛋白酶的陳述均是指作為物質的蛋白酶和相應的方法，特別是制備所述蛋白酶的方法。

分別與本發明的蛋白酶以及制備本發明蛋白酶的方法相關，作為本發明另外的主題的有編碼所述蛋白酶的核酸，含有本發明的蛋白酶或核酸的非人類宿主細胞，以及包含本發明蛋白酶的試劑，特別是洗滌劑和清洗劑、洗滌和清洗方法及由本發明蛋白酶所定義的用途。