[發明專利]性能增強和溫度抗性蛋白酶變體

在審

• 申請號: 201280052803.0
• 申請日: 2012-10-19
• 公開（公告）號: CN103906836A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: H·赫爾穆特;M·默克爾;B·勞夫斯;S·威蘭;T·奧康奈爾;S·通德拉;T·韋伯
• 申請（專利權）人: 漢高股份有限及兩合公司
• 主分類號: C12N9/54
• 分類號: C12N9/54
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 王健

1.一種蛋白酶，其包含在全長上與SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列，并且包含根據SEQ?ID?NO.1計數的氨基酸取代R99E或R99D與選自S3T、V4I和V199I的至少兩個另外的氨基酸取代的組合。

2.一種蛋白酶，特征在于其可由權利要求1的蛋白酶作為起始分子，通過單個或多個保守氨基酸取代而得，其中所述蛋白酶包含根據SEQ?ID?NO.1計數的氨基酸取代R99E或R99D與選自S3T、V4I和V199I的至少兩個另外氨基酸取代的組合，

和/或

其可由權利要求1的蛋白酶作為起始分子，通過片段化、缺失誘變、插入誘變、或取代誘變而得，并且包含在至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、265或266個連續相連氨基酸的長度上相應于所述起始分子的氨基酸序列，其中所述起始分子中含有的氨基酸取代R99E或R99D與選自S3T、V4I和V199I的至少兩個另外氨基酸取代的組合依然存在，

和/或

其可由權利要求1的蛋白酶作為起始分子，通過在比對中與SEQ?ID?NO.1的來自遲緩芽孢桿菌的蛋白酶的位置36、42、47、56、61、69、87、96、101、102、104、114、118、120、130、139、141、142、154、157、188、193、205、211、224、229、236、237、242、243、255和268相關聯的位置的一或多個氨基酸取代而得，其中該蛋白酶包含根據SEQ?ID?NO.1計數的氨基酸取代R99E或R99D與選自S3T、V4I和V199I的至少兩個另外氨基酸取代的組合。

3.用于制備蛋白酶的方法，包括將根據SEQ?ID?NO.1計數的氨基酸取代R99E或R99D與選自S3T、V4I和V199I的至少兩個另外氨基酸取代的組合引入到在全長上與SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列至少70％相同的起始分子中。

4.權利要求3的方法，還包括一或多個如下方法步驟:

(a)引入單個或多個保守氨基酸取代，其中所述蛋白酶包含根據SEQID?NO.1計數的氨基酸取代R99E或R99D與選自S3T、V4I和V199I的至少兩個另外氨基酸取代的組合；

(b)通過片段化、缺失誘變、插入誘變、或取代誘變修飾氨基酸序列，修飾的方式是，所述蛋白酶包含在至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、265、或266個連續相連氨基酸的長度上相應于所述起始分子的氨基酸序列，其中所述的氨基酸取代R99E或R99D與選自S3T、V4I和V199I的至少兩個另外氨基酸取代的組合依然存在；

(c)向一或多個在比對中與SEQ?ID?NO.1的來自遲緩芽孢桿菌的蛋白酶的位置36、42、47、56、61、69、87、96、101、102、104、114、118、120、130、139、141、142、154、157、188、193、205、211、224、229、236、237、242、243、255、和268相關聯的位置引入單個或多個氨基酸取代，其中所述蛋白酶包含根據SEQ?ID?NO.1計數的氨基酸取代R99E或R99D與選自S3T、V4I和V199I的至少兩個另外氨基酸取代的組合。

5.編碼權利要求1或2的蛋白酶或者編碼根據權利要求3或4的方法獲得的蛋白酶的核酸。

6.含有權利要求5的核酸的載體，特別是克隆載體或表達載體。

7.非人宿主細胞，其含有權利要求5的核酸或權利要求6的載體，或者含有權利要求1或2的蛋白酶，或者含有根據權利要求3或4的方法所獲得蛋白酶，特別是將蛋白酶分泌至包圍所述宿主細胞的培養基中的宿主細胞。

8.制備蛋白酶的方法，包括

a)培養權利要求7的宿主細胞，

b)從培養基或者從宿主細胞分離蛋白酶。