[發(fā)明專利]核酸擴(kuò)增方法、核酸基板、核酸分析方法及核酸分析裝置

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201280052238.8
• 申請日: 2012-10-19
• 公開（公告）號: CN103890161A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 齋藤俊郎;杉村禎昭
• 申請（專利權(quán)）人: 株式會社日立高新技術(shù)
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;C12Q1/68;C12N15/09
• 代理公司: 北京銀龍知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11243
• 代理人: 鐘晶;於毓楨

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種核酸的堿基序列解析中使用的核酸擴(kuò)增方法、核酸基板及核酸分析裝置。

背景技術(shù)

正在陸續(xù)開發(fā)確定DNA、RNA的堿基序列的新技術(shù)。以前，堿基序列的確定采用利用了電泳的方法，預(yù)先調(diào)制序列確定用DNA片段或根據(jù)RNA試樣進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的cDNA片段試樣，采用周知的桑格法(Sanger?method)實施雙脫氧反應(yīng)后，進(jìn)行電泳，測定分子量遷移展開譜圖(pattern)并進(jìn)行解析。

對此，近年來開發(fā)出將大量作為試樣的DNA片段固定在基板上，并行確定大量片段的序列信息的方法，使堿基解析速度得到了飛躍性提高。這些技術(shù)中，將擴(kuò)增作為解析對象的核酸序列得到的束(簇)配置在平面上，使用二維圖像傳感器進(jìn)行測定，從而平行解析多個樣品。例如，非專利文獻(xiàn)1中，通過使用固定在基板上的引物在基板上進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而在基板上形成擴(kuò)增基因片段的簇。此外，非專利文獻(xiàn)2中，進(jìn)行乳液PCR，在微粒表面對核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增和固定，并將該微粒固定在基板上，使多個樣品配置在平面上。

在這些超并聯(lián)型測序儀中，簇的形成是重要步驟，以高密度形成簇增加可以通過圖像傳感器一次獲取的序列信息，提高每簇的擴(kuò)增基因片段數(shù)可以提高序列信息的信號強(qiáng)度，提高序列信息的可靠性，同時實現(xiàn)檢測裝置的簡化。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1:日本特表2002-525125號公報

專利文獻(xiàn)2:日本特表2011-520420號公報

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1:Nucleic?Acids?Research,2000,vol.28,No.20,e87.

非專利文獻(xiàn)2:Science2005,vol.309,pp.1728-1732.

非專利文獻(xiàn)3:Nano?Letter2010,vol.10,pp.788-792.

非專利文獻(xiàn)4:P.N.A.S.2006,vol.103,pp.19635-19640.

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明要解決的問題

超并聯(lián)型測序儀中，通過二維圖像傳感器獲取由配置在平面上的擴(kuò)增基因簇產(chǎn)生的熒光或者發(fā)光反應(yīng)，得到各基因片段的序列信息。因此，隨著擴(kuò)增基因簇的密度的提高，則從一張圖像得到的序列信息量增加，有望實現(xiàn)高通量。

關(guān)于在基板上通過擴(kuò)增反應(yīng)制作多個簇的現(xiàn)有方法，例如專利文獻(xiàn)1中公開的那樣，將作為模板的試樣DNA隨機(jī)地散布在基板上，以預(yù)先固定在基板上的引物作為反應(yīng)起點進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。這種隨機(jī)散布模板DNA的方法中，如果想提高簇密度，則供給至一定面積的區(qū)劃內(nèi)的模板DNA相對于分子數(shù)的頻率分布為泊松分布，所以僅供給一分子模板DNA的區(qū)劃的極限是最大約37％。因此，例如，以向基板上平均500nm見方的區(qū)劃供給各一分子為目標(biāo)，理想狀態(tài)下應(yīng)該能夠獲得400萬個/mm²的簇密度，但即使對模板DNA濃度進(jìn)行最適化，也僅能獲得為其約1/3的130萬個/mm²的簇密度這樣的極限。也就是說，殘留的問題是，如果將作為模板的試樣DNA以高濃度固定，則模板DNA會緊挨著被固定在基板上，因此多種DNA會在同一區(qū)劃內(nèi)被擴(kuò)增，無法進(jìn)行正確的堿基序列解析；另一方面，如果將試樣DNA以低濃度固定，則簇密度會下降，通量會下降。

專利文獻(xiàn)2中還公開了一種方法，其在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)后，將其擴(kuò)增產(chǎn)物固定在預(yù)先形成于基板上的固定用墊上。但是，在該方法中，擴(kuò)增反應(yīng)為滾環(huán)擴(kuò)增(rolling?circle?amplification，RCA)反應(yīng)，難以實現(xiàn)超過10,000倍那樣的高擴(kuò)增倍率。為了以高通量進(jìn)行解析，不得不高速檢測熒光亮點，并優(yōu)選每簇的DNA片段數(shù)也多，但從DNA合成反應(yīng)速度方面考慮，僅憑實用的數(shù)小時的反應(yīng)時間的RCA反應(yīng)，難以實現(xiàn)超過10,000倍的高擴(kuò)增倍率。

本發(fā)明提供一種擴(kuò)增方法，其與根據(jù)泊松分布的比例而設(shè)定的簇密度相比，實現(xiàn)了更高的簇密度，同時將各簇內(nèi)的DNA片段數(shù)擴(kuò)增至可以容易檢測的10,000分子以上。

用于解決問題的手段

本發(fā)明的發(fā)明人等進(jìn)行深入研究的結(jié)果，開發(fā)出一種擴(kuò)增方法，其兼顧了與根據(jù)泊松分布求得的簇密度相比更高的簇密度、以及使簇內(nèi)的DNA片段數(shù)為10,000分子以上的高擴(kuò)增率。

特別是開發(fā)出了一種核酸擴(kuò)增方法，當(dāng)把500nm見方作為簇的一個區(qū)劃時，其簇密度與根據(jù)泊松分布求得的簇密度130萬個/mm²相比更高，且將簇內(nèi)的DNA片段數(shù)擴(kuò)增至10,000分子以上。