[發(fā)明專利]可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞的基于病毒的載體組合物

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201280047202.0
• 申請(qǐng)日: 2012-07-26
• 公開（公告）號(hào): CN103842500A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: P.布耶;H.韋尼奧;R.加永;Y.莫阿爾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 韋克塔里斯公司
• 主分類號(hào): C12N7/02
• 分類號(hào): C12N7/02
• 代理公司: 中國(guó)專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李波;梁謀

相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求2011年7月27日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序號(hào)61/512,289的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容通過引用以其整體并入本文。

前言

本發(fā)明提供了高滴度和純度的病毒載體組合物，以及用于生產(chǎn)所述組合物的方法，和所述病毒載體組合物用于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)的用途。本發(fā)明的方法包括多種特征，例如在無血清培養(yǎng)基中生產(chǎn)病毒載體顆粒，其提供了增強(qiáng)的所述病毒載體的生產(chǎn)。本發(fā)明的病毒載體組合物，由于它們的高滴度和純度，使在靶細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通常后發(fā)生有害的表型變化，如轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的亞群的損失，和對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的增殖、生存力和分化的影響減到最少。

發(fā)明背景

對(duì)于藥物發(fā)現(xiàn)中的體外應(yīng)用，在體內(nèi)和離體的臨床測(cè)定法以及對(duì)于基因治療，基于病毒的載體的使用已經(jīng)成為至關(guān)重要的遞送方法。病毒載體可以分為兩個(gè)主要類別：將其本身插入受體基因組中的整合載體，以及通常形成染色體外的遺傳元件的非整合型載體。整合載體如γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(RV)和慢病毒載體(LV)是穩(wěn)定遺傳的。非整合載體，例如腺病毒載體(ADV)和腺相關(guān)病毒(AAV)載體很快地從快速分裂的細(xì)胞丟失。影響具體載體選擇的一些因素，包括其包裝容量、其宿主范圍、其基因表達(dá)模式、其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，和其引發(fā)免疫反應(yīng)的能力(如果需要重復(fù)施用或轉(zhuǎn)導(dǎo)，這是特別成問題的)。這些參數(shù)的一些可以調(diào)整或控制。一個(gè)參數(shù)是使用高度濃縮而且還高度純化的載體，以允許有效的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，并避免由于載體本身之外的內(nèi)容物而導(dǎo)致的特異性細(xì)胞應(yīng)答。

目前用于生產(chǎn)和濃縮基于病毒的載體的方法對(duì)于保存載體完整性和批次質(zhì)量不是最佳的。事實(shí)上，小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)批次通常通過基于超速離心或在即用型中心單元(central?units)上離心的簡(jiǎn)單方法進(jìn)行濃縮。本文提及的這些批次，如批次A-血清(A-S)和B-血清(B-S)，和用于生產(chǎn)這些批次的方法，描述于圖4A。那些方法也濃縮細(xì)胞碎片、膜片段和由生產(chǎn)細(xì)胞分泌的和來自包含血清的培養(yǎng)基的蛋白，并且不適于在良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)下生產(chǎn)載體批次。這些批次中的一個(gè)主要缺點(diǎn)是：當(dāng)使用低或中等的感染復(fù)數(shù)(M.O.I.)時(shí)，它們不能允許一些非增殖細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或造血干細(xì)胞)的可重復(fù)的方式的高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。雖然采用更高的M.O.I.是達(dá)到高轉(zhuǎn)導(dǎo)水平的線索，但是通?？茖W(xué)家們專注于載體假型(pseudotyping)或轉(zhuǎn)導(dǎo)方案優(yōu)化，以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(Janssens等，2003)。然而，由于這樣的批次B-S誘導(dǎo)細(xì)胞毒性(Selvaggi等，1997；Reiser，2000；Baekelandt等，2003)，使用這種類型的產(chǎn)品B-S的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的結(jié)果總是在轉(zhuǎn)導(dǎo)水平和對(duì)靶細(xì)胞的毒性之間的平衡。此外，通過經(jīng)典技術(shù)濃縮的發(fā)表的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體的另一個(gè)缺點(diǎn)是所轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細(xì)胞，尤其是對(duì)造血干細(xì)胞，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后不能在分化途徑向下進(jìn)展。

Merten等(2010)使用基于多個(gè)基于膜和層析步驟的下游方法，但具有使用含10%血清的培養(yǎng)基的生產(chǎn)方法，這是Merten等的方法和根據(jù)本發(fā)明開發(fā)的方法之間的重要區(qū)別。本發(fā)明提供使用表現(xiàn)出高純度水平的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體的用于細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的組合物和方法。這樣的組合物和方法對(duì)干細(xì)胞分化成特化細(xì)胞沒有不利影響。

生產(chǎn)步驟對(duì)最終濃縮產(chǎn)品有很大的影響，因?yàn)樗峁┝穗S后進(jìn)行濃縮和純化步驟的起始材料。例如，可在具有或沒有血清，有或沒有丁酸鈉誘導(dǎo)的情況下進(jìn)行生產(chǎn)，并且上清液可以在轉(zhuǎn)染48h后收獲一次或在轉(zhuǎn)染64h和88h后收獲兩次(Cooper等，2011)。這樣的收獲時(shí)間的主要缺點(diǎn)是沒有考慮到載體顆粒半衰期。這些條件對(duì)初始污染物(DNA和/或蛋白污染物)的含量和粗上清液的毒性含量水平有很大的影響。必須測(cè)量這些成分以表征對(duì)應(yīng)生產(chǎn)、純化和濃縮的每個(gè)批次，即本發(fā)明的批次A、B、C和D。與本發(fā)明相反，Cooper等沒有通過測(cè)量初始污染物及其在濃縮和/純化加工后的去除來表征初始產(chǎn)品和純化的最終產(chǎn)物(參見表1)。

本發(fā)明提供了最終純化的基于RNA的病毒載體組合物，相比于存在于無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中的基于粗RNA的病毒載體的組合物，其包含小于2％的初始蛋白污染物和小于70至90％之間的初始的DNA污染物，所述組合物能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞而不顯著影響細(xì)胞生存力。

本發(fā)明提供了純化的基于RNA的病毒載體組合物，相比于存在于無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中的基于粗RNA的病毒載體的組合物，其包含小于2％的初始蛋白污染物和小于30?%的初始的DNA污染物，所述組合物能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞而不影響細(xì)胞生存力。