[發明專利]可用于轉導真核細胞的基于病毒的載體組合物

在審

• 申請號: 201280047202.0
• 申請日: 2012-07-26
• 公開（公告）號: CN103842500A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: P.布耶;H.韋尼奧;R.加永;Y.莫阿爾
• 申請（專利權）人: 韋克塔里斯公司
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李波;梁謀

1.純化的基于RNA的病毒載體組合物，相比如存在于無血清細胞培養基中的基于粗RNA的病毒載體的組合物，其包含小于2％的初始蛋白污染物和小于70%至多達90%，優選小于30%的初始DNA污染物，所述組合物能夠轉導真核細胞而不影響細胞生存力。

2.權利要求1的基于RNA的病毒載體組合物，其中所述基于粗RNA的病毒載體是其中物理顆粒/轉導單位(PP/TU)包括在100：1至多達900：1之間，優選100：1至多達600：1之間，更優選100：1至多達400：1之間的病毒載體。

3.權利要求1或2的基于RNA的病毒載體，其中所述病毒載體對細胞增殖、生存力和/或細胞的能力，例如干細胞分化或例如原代細胞重編程為多能細胞的能力，具有很少至沒有影響。

4.包含在細菌宿主中的病毒DNA構建體，所述細菌宿主以保藏號CNCM?I-4487或CNCM?I-4488或CNCM?I-4489保藏在CNCM保藏中心。

5.權利要求1至3中任一項的基于RNA的病毒載體的用途，其用于轉導真核靶細胞以將目的核酸(轉基因)轉移到所述細胞中。

6.用于制備修飾的真核細胞的方法，其中通過根據權利要求1-3中任一項的純化的基于RNA的病毒載體組合物轉導所述細胞而不影響它們的生存力。

7.用于生產基于RNA的逆轉錄病毒顆粒的方法，其包括：

(i)?轉染生產細胞，所述細胞經過修飾以補充在病毒載體所基于的RNA病毒基因組中的缺失，并且在合適的條件下培養所述生產細胞，以允許病毒載體顆粒的生產，其中所述轉染后的培養在無血清培養基中進行；

(ii)?收集包含所述基于RNA的病毒載體顆粒的上清液。

8.權利要求7的方法，其不包括丁酸鈉誘導的步驟。

9.權利要求7或8的方法，其中所述上清液收集通過以特定時間間隔的包括在3個和6個之間的多個步驟進行。

10.權利要求7-9中任一項的方法，其中在所述上清液收集之后，通過離心澄清。

11.權利要求7-10中任一項的方法，其進一步包括切向超濾和滲濾的步驟，所述超濾優選在聚砜中空纖維濾芯上操作。

12.權利要求7-11中任一項的方法，其進一步包括離子交換層析的步驟。

13.可通過根據權利要求7-12中任一項的方法獲得的純化的基于RNA的病毒載體組合物。

14.權利要求13的基于RNA的病毒載體組合物，其中去除的DNA污染物占70至99％之間，優選多達71%的存在于初始無血清培養基的這種污染物，并且去除的細胞蛋白污染物占50至99.9％之間，優選多達56%的包含在初始無血清培養基中的細胞蛋白，并且其中所述PP/TU比例包括100：1至900：1之間，優選100：1和600：1之間。

15.制備遺傳修飾的真核細胞的方法，其包括使真核細胞接觸權利要求1-3，13或14中任一項的基于RNA的病毒載體組合物。

16.修飾的真核細胞，其中所述細胞通過根據權利要求1-3，13或14中任一項的基于純化的RNA的病毒載體組合物轉導而不影響其生存力。