[發(fā)明專利]非B亞型GAG蛋白在慢病毒包裝中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201280046712.6
• 申請日: 2012-09-25
• 公開（公告）號: CN104039968B
• 公開（公告）日: 2018-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: T-L·特蘭;P·沙紐;C·伯奇
• 申請（專利權(quán)）人: 賽拉福柯蒂斯公司;巴斯德研究院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C07K14/16
• 代理公司: 上海專利商標事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 楊昀

本發(fā)明涉及慢病毒包裝載體，所述慢病毒包裝載體包含非B亞型gag?pol序列，尤其是D亞型gag?pol序列。本發(fā)明還涉及用于制備和使用這些載體的方法。本發(fā)明還涉及包含HIV?1非B亞型Gag和/或Pol蛋白的慢病毒載體顆粒。

背景技術(shù)

重組疫苗已隨重組DNA技術(shù)的進步而發(fā)展，重組DNA技術(shù)能夠修飾病毒基因組以產(chǎn)生修飾的病毒。通過這種方式，已能夠?qū)⑦z傳序列引入非致病性病毒，從而它們編碼需要在干擾后于靶細胞內(nèi)得以表達的免疫原性蛋白質(zhì)，以在其宿主內(nèi)發(fā)展特定免疫應(yīng)答。

此類疫苗構(gòu)成了疫苗技術(shù)中的重大進步(Kutzler等,Nat Rev Genet,9(10):776-788,2008)。具體而言，它們具有優(yōu)于傳統(tǒng)疫苗的優(yōu)勢：避免活(減毒的)病毒和消除滅活疫苗制造的相關(guān)風險。

采用經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒(逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)的基因遞送在上世紀80年代早期由Mann等描述(Cell,33(1):153-9,1983)。最常用的致瘤性逆轉(zhuǎn)錄病毒基于莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MLV)。其基因組簡單，從該基因組產(chǎn)生多聚蛋白質(zhì)Gag、Pol和Env，并以反式形式供病毒復(fù)制所需(Breckpot等,2007,Gene Ther,14(11):847-62;He等，2007,ExpertRev vaccines,6(6):913-24)。一般需要的順式序列是長末端重復(fù)序列(LTR)及其如下周邊序列：整合所需的反向重復(fù)序列(IR或att位點)、包裝序列Ψ、轉(zhuǎn)運RNA結(jié)合位點(引物結(jié)合位點，PBS)，和逆轉(zhuǎn)錄涉及的一些其它序列(LTR內(nèi)的重復(fù)R，以及多嘌呤序列(PPT)，正鏈起始所必需)。為了生成復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通常使gag、pol和env基因全部缺失，并且用表達盒替代。

源自慢病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(即，慢病毒載體)已涌現(xiàn)為用于基因治療和免疫治療目的的有希望的工具，因為它們顯示優(yōu)于其它病毒系統(tǒng)的若干優(yōu)勢。具體而言，慢病毒載體本身無毒，并且不像其它逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細胞，尤其是樹突細胞(He等，2007,Expert Rev vaccines,6(6):913-24)，這允許通過內(nèi)源性通路的抗原遞呈。慢病毒代表逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)的一個慢病毒(slow virus)屬，其包括人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、馬傳染性腦炎病毒(EIAV)、山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和貓免疫缺陷病毒(FIV)。慢病毒可以無限地持續(xù)存在于其宿主內(nèi)，并且在一生的感染期間以不同速度連續(xù)復(fù)制。所述病毒在其宿主內(nèi)的持續(xù)復(fù)制取決于其避開宿主防御的能力。

重組慢病毒載體的設(shè)計基于所述慢病毒的順式與反式作用序列的分離。非分裂細胞中的有效整合與復(fù)制需要所述慢病毒基因組中存在兩種順式作用序列：中心多嘌呤序列(cPPT)和中心終止序列(CTS)。它們導(dǎo)致形成三鏈DNA結(jié)構(gòu)，稱為中心DNA“瓣(flap)”，該結(jié)構(gòu)使基因進入非分裂細胞(包括樹突細胞(DC))核內(nèi)的效率最大化(Zennou等,2000,Cell,101(2)173-85;Arhel等,2007,EMBO J,26(12):3025-37)。

已經(jīng)基于由包裝構(gòu)建體為反式包裝載體提供B亞型Gag、Pol、Tat和Rev蛋白而生成了HIV-1慢病毒載體(Naldini等,PNAS15:11382-8(1996);Zufferey等,NatureBiotechnology15:871-875,1997);Dull等,Journal of Virology(1997))。這些研究采用B亞型Gag和Pol蛋白進行。而HIV-1包裝構(gòu)建體中非B亞型gag和pol序列的作用還未經(jīng)評估。