[發明專利]用于降解有機磷酸酯的酶

有效

• 申請號: 201280045762.2
• 申請日: 2012-07-20
• 公開（公告）號: CN103814127B
• 公開（公告）日: 2017-02-08
• 發明（設計）人: C·斯科特;J·奧克肖特;R·拉塞爾;N·弗倫克;S·科措尼斯;劉凱燕
• 申請（專利權）人: 聯邦科學工業研究組織
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C07K14/195;C12N15/55;A61K38/46;C07K19/00;C07K17/00;C12N15/29;B09C1/10;C12Q1/34
• 代理公司: 北京戈程知識產權代理有限公司11314
• 代理人: 程偉

技術領域

本發明涉及能夠水解有機磷酸酯（organophosphate）（OP）分子的酶。

背景技術

有機磷酸酯（OP）殺蟲劑殘余物是環境以及一系列日用品中不期望的污染物。尤其敏感的領域包括土壤的污染、再循環的灌溉廢水的污染（廢水被下游的灌溉者使用或允許直接流出農場）、以及在農業和園藝出口商品中存在超出允許水平的殘余物。有機磷酸酯中毒是暴露在此類化學品的農業工人面臨的一個問題，對于暴露在化學戰中所用的有機磷酸酯的軍事人員也是如此。此外，儲備的有機磷神經毒劑也需要對這些儲備進行解毒處理。因此，需要一些生物修復（bioremediation）策略來清除或減少此類有機磷酸酯的殘余物和/或儲備。

提出的一個方案涉及使用能夠固定或降解有機磷酸酯殘余物的酶。例如，這些酶可用于生物反應器中，污染的水可能會流經所述生物反應器，或是在對水果、蔬菜或動物產品進行收獲后殺蟲（disinfestation）后用在洗滌溶液中以便降低殘余物的水平和存留時間（withholding?time）。適合用于對有機磷酸酯殘余物進行降解的酶包括來自細菌的OP水解酶(Mulbry,1992；Mulbry和Kearney,1991；Cheng等，1999；US5,484,728；US5,589,386;Dong等，2005)、來自脊椎動物的OP水解酶(Wang等，1993；1998；Gan等，1991；Broomfield等，1999)、以及來自OP抗性昆蟲的OP水解酶(WO95/19440和WO97/19176)。要求OP水解酶應該能夠快速降解有機磷酸酯殘余物。

研究得最為深入的OP降解酶是細菌的有機磷酸酯二水解酶(organophosphate?dihydrolase，稱為OPD、OPH或PTE)，其由黃桿菌菌種（Flavobacterium?sp.）ATCC27551和缺陷短波單胞菌MG（Brevundimonas?diminuta?MG）中的不同質粒上相同基因編碼(Harper等，1988；Mulbry和Karns,1989)。OPD是一種同二聚體蛋白，能夠水解很多種磷酸三酯（氧OP和硫OP均可）（Dumas等，1989a,b）。其反應機制直接或間接地涉及金屬離子，優選為Co⁺⁺、也包括Zn⁺⁺、Cd⁺⁺、Fe⁺⁺和其它二價陽離子。OPD對于磷酸單酯或二酯沒有可檢測到的活性(Dumas等，1989a,b；1990)。

已經在大腸桿菌（Escherichia?coli）(ePHP)、結核分枝桿菌（Mycobacterium?tuberculosis）(mtPHP)和肺炎支原體（Mycoplasma?pneumoniae）(mpPHP)的基因組中鑒定出了OPD同源物（磷酸三酯酶同源蛋白，或PHP），不過僅對ePHP的磷酸三酯酶活性進行了測試(Scanlan和Reid,1995；Buchbinder等，1998)。在ePHP的粗裂解物中未檢測到對任何測試的底物具有活性，例如p-硝基苯乙酸酯、雙(p-硝基苯)磷酸酯、對氧磷（paraoxon）和p-硝基苯磷酸酯。已鑒定出一類相關性更遠的蛋白，其具有非常低水平的OP水解酶活性但是高水平的內酯酶活性，同樣OPD酶也具有非常低水平的內酯酶活性（小于針對OP底物活性的0.001%）（Afriat等人，2006）。

在脊椎動物中也鑒定出了OPD同源物(Davies等，1997)，盡管其在這些生物中的功能仍是未知的。OPD、ePHP、mtPHP和哺乳動物的PHP在氨基酸水平具有27-30%的同一性，不過mpPHP的相似性稍低。在迄今為止所鑒定到的磷酸三酯酶家族的所有成員中，參與Zn⁺⁺結合的氨基酸殘基都是保守的(Buchbinder等，1998)。

最近，從農桿菌中（Agrobacterium）分離出OP降解酶（WO02/092803;Horne等，2002;Jackson等，2009）。這種酶又稱為OpdA，因其與OPD具有90%的氨基酸序列同一性。盡管OpdA與OPD在氨基酸水平上相關，它們已顯示出針對不同OP的不同活性。

需要可用于生物修復策略中的其它OP降解酶。特別是，需要針對特定OP具有增強的活性的可用于生物修復領域的酶。

發明內容

本發明已鑒定的多肽與天然存在的OpdA相比具有改進的活性。

因此，在一方面，本發明提供一種多肽，其含有序列為如下的氨基酸：

i)如SEQ?ID?NO:1所示，