[發明專利]用于確定蛋白水解酶活性的方法(變體)、用于實現該方法的裝置以及診斷方法

無效

• 申請號: 201280045249.3
• 申請日: 2012-07-16
• 公開（公告）號: CN103998620A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 法佐伊爾·伊諾亞托維奇·阿陶拉哈諾夫;納塔利婭·米哈伊洛芙娜·達什克維奇;米哈伊爾·弗拉基米羅維奇·奧瓦涅索夫;瓦西里·伊萬諾維奇·薩爾巴什;米哈伊爾·亞歷山德羅維奇·潘捷列夫;謝爾蓋·謝爾蓋耶維奇·卡拉姆津;安德烈·尤爾耶維奇·孔德拉托維奇
• 申請（專利權）人: 血液有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/56
• 分類號: C12Q1/56;G01N21/76;G01N21/64;G01N33/48
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 余剛;張英

技術領域

本發明涉及醫學和生物學，并且具體地，可以用于診斷和研究目的以確定血液及其組分的凝血特征以及用于生物技術、藥理學以及基礎生物研究中。

背景技術

目前，在復雜生物系統的動態以及在這些具有空間非均勻性的系統中所發生的過程的研究中存在重大問題。這些過程具體地包括凝血、補充、細胞凋亡、消化、纖維蛋白溶解，其中蛋白水解酶(蛋白酶類)起關鍵作用。

如果蛋白水解酶的濃度不隨時間變化并且在所分析的樣品的各個點都是相同的，則可以使用特異性熒光底物或生色底物測量該濃度。目前，存在在基礎研究和相應生物系統功能障礙的診斷中使用的測量濃度隨時間變化的方法。為了確定凝血病癥，現在使用血漿中凝血酶產生的測試，其公開在基礎性論文：Hemker?HC，Wielders?S.，Kessels?H.，Beguin?S.，Continuous?registration?ofthromb?in?generation?in?plasma,its?use?for?the?determination?ofthe?thrombin?potential，J?Thromb?Haemost.1993，Oct.18，70(4)：617-24中。該測試已顯示出優于常規凝血測試的多個優勢，但是它是空間均勻的，即研究了均勻的環境。這與如下所述的生物體中的情況不相對應。

圖1示意性顯示了凝血調控的空間概念。凝血由表達跨膜蛋白-組織因子(非酶輔因子)的細胞激活，跨膜蛋白-組織因子是凝血因子(左)并且增長深至血漿中。凝血酶的產生是通過激活的因子X(因子Xa，絲氨酸蛋白酶)一凝血酶原酶的限制組分調節的。僅通過外在X酶(extrinsic?tenase)(組織因子和因子VIIa的絲氨酸蛋白酶的復合物)的因子Xa的產生確定激活劑附近的凝血(開始期)。然而，因子Xa快速受到抑制并且不能擴散遠離該激活劑。因此，在凝塊增長期，它是通過內在X酶形成的。內在X酶的限制組分凝血因子IXa是通過外在X酶產生的。與因子Xa相反，IXa緩慢受到抑制并因此擴散較遠。隨著凝血的進一步增加，通過因子XIa產生了額外的因子IXa，反過來它是通過正反饋環中的凝血酶產生的。由于凝血調節蛋白的作用，凝塊形成停止：負反饋環激活蛋白C，其通過破壞因子Va和VIIIa終止凝血酶的增加(參見，Panteleev?M.A.，Ovanesov?M.V.，Kireev?D.A.，Shibeko?A.M，Sinauridze?E.I.，Ananyeva?N.M.，Butylin?A.A.，Saenko?E.L.，and?Ataullakhanov?F.I.，Spatial?Propagation?and?Localization?ofBlood?Coagulation?Are?Regulated?by?Intrinsic?and?Protein?C?Pathways，Respectively，Biophys?J.2006Mar1；90(5)：1489-500)。盡管可以修正這種概念的一些細節，但是擴散過程的重要作用以及在凝血中的空間非均勻性是毫無疑問的(Hoffman?M.，Monroe?DM3^rd，Acell?based?model?of?hemostasis，Thromb?Haemost.2001Jun；85(6)：958-65)。

凝血酶是凝血系統的關鍵酶。它催化主反應-纖維蛋白原向纖維蛋白的轉化。另外，正是凝血酶激活了凝血因子V、VIII、VII、XI、XIII、蛋白C、血小板、凝血酶-激活的纖維蛋白溶解抑制劑。在凝血中，所產生的凝血酶的量比其它蛋白酶類中的一種大10-100倍，這有利于它的檢測。

在凝血酶催化的反應中，纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，其聚合并因此使血漿膠凝。

凝血研究具有重大實際意義，因為它們不僅使得能夠診斷某些疾病，而且還使得可以評估影響凝血參數的藥物活性。