[發明專利]臍帶提取物的制備方法和使用方法

在審

• 申請號: 201280044164.3
• 申請日: 2012-07-11
• 公開（公告）號: CN103998048A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 崔容秀;金仙美;李榮濬
• 申請（專利權）人: 車比奧及戴奧斯泰有限公司
• 主分類號: A61K35/44
• 分類號: A61K35/44;A61K35/12;C12N5/074;A61K8/98;A61P17/00
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 閔丹

相關申請

本申請要求在韓國知識產權局2011年7月12日提交的韓國專利申請No.10-2011-0068761和2011年7月11日提交的韓國專利申請No.10-2011-0068261的權益，這兩者的公開內容均通過引用而完整并入本文。

發明領域

本發明的一個或多個實施方案涉及制備臍帶提取物的方法、臍帶提取物的血清替代物、用于分離和培養干細胞的組合物、和填充劑(filler)用于傷口愈合的用途。

發明背景

自建立身體外動物細胞培養系統以來，血清一直被常規用于促進動物細胞的增殖。已廣泛用于原代細胞和穩定細胞系的存活和增殖的血清，是一種僅其部分組成已知的混合物，如此尚未完全了解細胞培養中血清的生物學活性。還有，胎牛血清(FBS)從胎牛收集，如此FBS具有風險因子如支原體、病毒、朊病毒、細菌促細胞分裂原、激素、外來蛋白質、生長因子和蛋白酶。此外，根據供應商的設備、技術標準和生產批號，FBS組成的質量可能變化。已知迄今報告的基礎培養基(basal?media)能使特定細胞生長；代替血清使用的細胞生長因子、粘附因子等是昂貴的；且已知基礎培養基中的生長和代謝物生產沒有在包含血清的培養基中的那些那么穩定(Cruz?J.H.等,Cytotechnology,26:59-64(1998)和Hee-Chan?Lee,A?Basal?medium?in?an?Animal?Cell?Culture,Biotechnology?News,2(3):242-252(1994))。

還有，包括FBS在內的培養基常規用于連續培養處于未分化狀態的成人干細胞，而源自動物的蛋白質源(包括FBS)在培養期間使用，其可能導致穩定性問題如在開發用于臨床應用的干細胞治療物時在物種之間的污染。因此，從常規培養方法獲得的干細胞的臨床應用具有許多局限性。

作為一種克服使用源自動物的蛋白質源(即FBS)的問題的方法，可使用一種利用基礎培養基的方法和一種使用包含人血清的培養基的方法。使用基礎培養基的方法包括在含大量細胞因子如生長激素的培養基中培養干細胞，如此該方法是麻煩且不經濟的。還有，使用包含人血清的培養基的方法還包括使用通過重組方法制備的大量細胞因子和使用昂貴的人血清作為蛋白質源來進行培養，如此該方法是經濟上低效的。

同時，干細胞可分類為成人干細胞(見于成人的各種組織和器官中)和胚胎干細胞(可從囊胚階段(blastodermic?stage)的細胞獲得)。胚胎干細胞具有分化成各種細胞如神經細胞、血液細胞和胰腺細胞的全能性(pluripotency)；然而，胚胎干細胞自人胚胎獲得，如此受制于倫理問題。因此，不存在倫理問題的成人干細胞可容易地分離和培養，且能分化成各種細胞，如此，更多的關注將成人干細胞作為細胞治療產品的材料。

可從多種組織分離成人干細胞，其為可分化成各種組織細胞如脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、心細胞、肝細胞和神經細胞的未分化的干細胞。其中，源自骨髓的間充質干細胞(BM-MSC)是成人干細胞的一個代表性的例子。

然而，當干細胞供體的年齡增長時，BM-MSC的數目和增殖效力降低，而且骨髓提取對供體引起很大疼痛。因此，試圖從不同組織分離間充質細胞。由于最近有各種報告稱間充質細胞可從成人或胚胎的外周血、臍帶、胎盤和臍帶血分離，因此從各種組織獲得的間充質細胞作為新的細胞治療產品的來源受到大量關注。

臍帶包含血管和血管周圍的結締組織(稱為Wharton's?jelly)。在妊娠期間，臍帶的長度可以為約30cm至60cm，臍帶的重量可以為約40g至約50g。而且，臍帶包含用于供應給胎兒的充足量的營養物、干細胞和前體細胞。最近，已報告源自臍帶的細胞具有BM-MSC特性。類似于骨髓和其他組織來源的間充質干細胞，臍帶來源的干細胞表達細胞表面蛋白質如CD73、CD90、CD105、CD10、CD13、CD29、CD44和HLA-ABC，但不表達細胞表面蛋白質如CD34和CD45(其為造血干細胞標志物)以及CD14、CD31、CD33和HLA-DRα(其為組織相容性抗原)。此外，已報告從臍帶分離的干細胞同時表達Oct4、Sox2、Nanog等胚胎干細胞標志物。

臍帶來源的干細胞可分化成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞，且比骨髓或脂肪來源的細胞在體外培養期間具有更好的有絲分裂活性。還報告臍帶來源的干細胞可分化成心肌細胞和神經細胞。在這一方面，臍帶是一種可供應干細胞用于臨床應用的組織，且可用作細胞治療產品。