[發(fā)明專利]用于檢測液態(tài)介質(zhì)中纖溶酶原的方法、相關(guān)組合物及試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201280043372.1
• 申請日: 2012-09-07
• 公開（公告）號: CN103946390A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 讓·埃米雷爾
• 申請（專利權(quán)）人: 希森美康株式會社
• 主分類號: C12Q1/56
• 分類號: C12Q1/56;G01N33/86
• 代理公司: 北京市安倫律師事務(wù)所 11339
• 代理人: 李瑞峰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于檢測試樣中纖溶酶原的方法，具體的涉及通過液體試劑來檢測試樣中纖溶酶原的方法，更具體的涉及通過可以長期保存的即用型試劑來檢測試樣中纖溶酶原的方法。

此類檢測要求激活試樣中的纖溶酶原，這一般是利用鏈激酶來實現(xiàn)的。

關(guān)于此點，溶液由鏈激酶和鏈激酶激活劑（纖維蛋白原）組成。但是，纖維蛋白原難以以液體形態(tài)保存，導(dǎo)致檢測結(jié)果會隨著纖維蛋白原的保存時間做函數(shù)變化。

背景技術(shù)

因此，為了克服以上缺陷，第5879823號美國專利公開了一種利用氨基酸確定的寡肽來進行穩(wěn)定的纖溶酶溶液。該溶液并不完全令人滿意，因為它僅局限于所述纖溶酶溶液的穩(wěn)定，而不適用于纖溶酶原激活劑溶液（如纖維蛋白原）的穩(wěn)定。另外，該溶液也無法滿足利用在病人抽血很久之前制備的即用型液體制劑對患者血液中存在的纖溶酶原進行檢測的需要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷并具體的提供用于檢測試樣中纖溶酶原的方法，所述方法包括以下步驟：?????

a?將反應(yīng)物i，即鏈激酶和鏈激酶激活劑，與反應(yīng)物ii，即校核液或稀釋血漿試樣，進行反應(yīng)；?????

b?利用反應(yīng)追蹤物（SPm）來追蹤所述反應(yīng);?????

c?確定所述校核液或稀釋血漿試樣中纖溶酶原的量，將其作為所述反應(yīng)追蹤結(jié)果的函數(shù)。

在優(yōu)選具體實施方式中，所述方法由以上步驟組成。

根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的鏈激酶激活劑為一種或多種化合物，所述化合物選自纖維蛋白DD片段和/或DD片段衍生物組成的組。所述的DD（或D-二聚體）片段，是指含有兩個來自不同纖維蛋白原（fibrogen）分子的交叉連接D區(qū)域的纖維蛋白的次級片段，其可通過例如纖維蛋白酶解法來獲得。

因此，本發(fā)明所使用的DD片段可以來自纖維蛋白或裂解的血凝塊。也可以使用重組DD片段。還可以使用不純DD片段，例如纖維蛋白降解碎片。所述DD片段衍生物是指包括至少某些上述DD片段的分子，特別是鏈激酶激活過程中所涉及的DD片段的氨基酸。在優(yōu)選具體實施里中，所述衍生物與所述DD片段具有至少70%的序列一致性，更優(yōu)選的具有至少80%的序列一致性，最優(yōu)選的具有至少90%或95%以上的序列一致性。

在一個優(yōu)選實施方式中，所述DD片段衍生物可以包括例如比DD片段更多的氨基酸并且包括例如D-二聚體/片段E復(fù)合物。

所述反應(yīng)追蹤物或化合物（SPm）可以為例如接枝在基材、鏈激酶和鏈激酶激活劑形成的酶產(chǎn)物或所述酶上的分子。所述接枝可以通過例如化學(xué)合成來進行。所述反應(yīng)追蹤物或化合物（SPm）也可以為能夠與基材、所述酶的產(chǎn)物或所述酶相連的分子。

被選定的所述追蹤物或化合物能夠通過例如生成顏色或熒光或?qū)е骂伾驘晒庀Щ蚴峭ㄟ^改變所述反應(yīng)介質(zhì)的吸光度來追蹤所述酶的反應(yīng)。

在優(yōu)選具體實施方式中，反應(yīng)追蹤化合物為專門用于纖溶酶和纖溶酶-鏈激酶復(fù)合物的顯色基材。此類化合物在本領(lǐng)域內(nèi)已知的例子包括但不限于由Chromogenix出售的S-2403^TM和S-2251^TM以及Hyphen?Biomed公司出售的SPm41。

在優(yōu)選具體實施方式中，所述反應(yīng)可以在抗凝劑存在的情況下進行，所述抗凝劑優(yōu)選的為水蛭素或任何其它凝血酶抑制劑。

優(yōu)選的，所述方法包括在反應(yīng)步驟a之前的將所述鏈激酶激活劑存放在即用型溶液中的步驟。因此，所述方法并不要求在使用前才制備鏈激酶激活劑溶液。另外，所述鏈激酶激活劑在溶液中處于穩(wěn)定狀態(tài)并可與例如鏈激酶共同保存，而不會改變其理化性質(zhì)和在所述纖溶酶原檢測進行中的效能。在優(yōu)選具體實施方式中，所述鏈激酶和鏈激酶激活劑可以共同封裝。

在優(yōu)選具體實施方式中，所述鏈激酶激活劑存放步驟在溫度處于-20℃和37℃之間時進行。在優(yōu)選具體實施方式中，所述鏈激酶激活劑的存放溫度為2-10℃，更優(yōu)選的為4-8℃。在優(yōu)選具體實施方式中，所述鏈激酶激活劑適于存放在室溫下或不要求特定存放條件。

根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式，所述存放步驟可以持續(xù)12小時以上，優(yōu)選的持續(xù)24小時至24個月，更優(yōu)選的持續(xù)24小時至18個月。

作為可選項，所述鏈激酶激活劑在防腐劑和/或抗生素（如環(huán)丙沙星）存在的情況下存放。

優(yōu)選的，所述方法還包括在所述反應(yīng)步驟a之前將所述鏈激酶（R1）和鏈激酶激活劑保持在約37℃的預(yù)溫育(pre-incubation)步驟。