[發(fā)明專利]植物轉(zhuǎn)化方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201280036070.1
• 申請日: 2012-07-20
• 公開（公告）號: CN103826439A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: Y-F·常;A·S·萬古麗;L·格里斯特;H·圖特勒;H·P·洪;P·奧爾霍夫特
• 申請（專利權(quán)）人: 巴斯夫植物科學(xué)有限公司
• 主分類號: A01H1/00
• 分類號: A01H1/00;C12N15/67;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京市中咨律師事務(wù)所 11247
• 代理人: 凌立;黃革生

本發(fā)明涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法。所述方法尤其包括以下步驟：a)提供包含下胚軸或其部分、至少一個(gè)子葉和損傷組織的損傷的可轉(zhuǎn)化外植體，b)轉(zhuǎn)化所述外植體包含的細(xì)胞，和c)將所述外植體轉(zhuǎn)移到包含針對選擇標(biāo)記的至少一種選擇化合物的生長培養(yǎng)基上。此外，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明的方法可獲得的植物。

在1984年首次為煙草描述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化目前廣泛用于將基因?qū)胫参镏校糜诨A(chǔ)研究以及產(chǎn)生商業(yè)使用的轉(zhuǎn)基因作物的目的。能夠成功轉(zhuǎn)化的植物包括大部分主要的經(jīng)濟(jì)作物、蔬菜、觀賞植物、藥用植物、水果、樹木和牧草植物。

植物轉(zhuǎn)化主要通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化來完成。農(nóng)桿菌是天然存在的病原土壤細(xì)菌，其能夠轉(zhuǎn)移DNA進(jìn)入植物細(xì)胞的基因組中。對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化，將目的基因置于農(nóng)桿菌T-DNA(轉(zhuǎn)移DNA)的左邊界和右邊界重復(fù)序列之間。隨后，使用合適的植物轉(zhuǎn)化方案(對于綜述參見Gelvin，2003Microbiol?Mol?Biol?Rev.67(1)：16-37)將含有目的基因的T-DNA區(qū)穩(wěn)定整合到植物基因組中。

除了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化之外，還存在其他植物轉(zhuǎn)化方法，如病毒轉(zhuǎn)化、植物原生質(zhì)體的電穿孔和粒子轟擊。

一般而言，植物轉(zhuǎn)化技術(shù)基于相同的原理。在第一步中，將目的基因?qū)牒线m的轉(zhuǎn)化載體中。隨后將攜帶有目的基因的轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入目標(biāo)植物的再生細(xì)胞中。由于僅有一小部分的目標(biāo)細(xì)胞接受了目的基因，因此在大量過量的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的選擇。此外，一旦已經(jīng)將目的基因穩(wěn)定導(dǎo)入宿主細(xì)胞的基因組中，那么確定再生條件以從單個(gè)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生完整植株至關(guān)重要(參見例如Birch，1997，Annu.Rev.Plant?Physiol.Plant?MoI.Biol.48：297-326)。

最簡單可用的基于農(nóng)桿菌的植物轉(zhuǎn)化方法之一是“浸花轉(zhuǎn)化”。浸花是種系轉(zhuǎn)化方法，通過所述方法可以將目的基因轉(zhuǎn)化到產(chǎn)生種子的細(xì)胞中。該方法涉及在農(nóng)桿菌細(xì)胞的懸浮液中浸泡植物(開花早期階段)(Clough和Bent，1998，Plant?J16：735-43)。浸泡后幾周，收集浸泡植物的種子，并選擇轉(zhuǎn)化體的種子群體。浸花轉(zhuǎn)化技術(shù)的優(yōu)勢是它避免使用成本密集并需要受過訓(xùn)練的工作人員的組織培養(yǎng)和植物再生。不幸的是，小的植物尺寸、短的世代時(shí)間以及每株植物大量的種子是用于浸花的必要條件。因此，該轉(zhuǎn)化方法僅僅成功地應(yīng)用于少數(shù)物種，主要用于擬南芥(Arabidopsis?thaliana)(但還有蒺藜苜蓿(Medicago?truncatula)和蕓苔(Brassica)，參見Wang等2003.Plant?Cell?Reports22：274-281)。

認(rèn)為難以進(jìn)行種系轉(zhuǎn)化的完整轉(zhuǎn)化植物的再生是植物轉(zhuǎn)化中的瓶頸，這是由于再生難以實(shí)現(xiàn)，耗時(shí)并且需要特殊設(shè)備。

植物再生的第一步通常在體外條件下進(jìn)行，即在無菌條件下的特殊營養(yǎng)培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)化目標(biāo)細(xì)胞后，通過特定的植物激素誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，以從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中生長出愈傷組織。愈傷組織誘導(dǎo)后，將所獲的愈傷組織轉(zhuǎn)移到允許枝條誘導(dǎo)的培養(yǎng)基上。將愈傷組織在所述培養(yǎng)基上培養(yǎng)(在體外條件下)直至形成枝條。枝條形成后，將枝條轉(zhuǎn)移到允許根形成的培養(yǎng)基上(在體外條件下)。根形成后，一般將再生的小植株(即具有根的枝條)從體外條件轉(zhuǎn)移到離體(ex?vitro)條件下，主要轉(zhuǎn)移到溫室條件下的土壤中。因此，愈傷組織誘導(dǎo)、枝條誘導(dǎo)和根誘導(dǎo)一般均在體外條件下進(jìn)行。

然而，體外條件下再生植物的當(dāng)前方法具有一些缺點(diǎn)。在體外條件下再生完整植物花費(fèi)高，并且需要特殊的營養(yǎng)培養(yǎng)基、特殊的設(shè)備和受過訓(xùn)練的工作人員。當(dāng)然，常常存在污染的風(fēng)險(xiǎn)(例如，真菌污染)。如果組織培養(yǎng)受到污染，數(shù)周或甚至數(shù)月的工作可能都會前功盡棄。

然而，不采用組織培養(yǎng)，植物轉(zhuǎn)化是有挑戰(zhàn)的，這是由于組織培養(yǎng)

a)允許分別選擇轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞(和植物枝條)并且

b)同時(shí)抑制了細(xì)菌和真菌微生物的生長。不進(jìn)行選擇的話，難以鑒定攜帶轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞、植物枝條或小植株(即具有枝條和根的植物)。