[發明專利]植物轉化方法

在審

• 申請號: 201280036070.1
• 申請日: 2012-07-20
• 公開（公告）號: CN103826439A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: Y-F·常;A·S·萬古麗;L·格里斯特;H·圖特勒;H·P·洪;P·奧爾霍夫特
• 申請（專利權）人: 巴斯夫植物科學有限公司
• 主分類號: A01H1/00
• 分類號: A01H1/00;C12N15/67;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 凌立;黃革生

1.用于產生轉基因植物的方法，其包括以下步驟：

a)提供損傷的可轉化外植體，其包含下胚軸或其部分、至少一個子葉和選自以下的損傷組織：

i.初生葉節或更高葉節的損傷的分生組織，

ii.子葉節的損傷的分生組織，和

iii.損傷的上胚軸組織，

b)利用包含選擇標記基因的至少一個植物表達盒的多核苷酸轉化所述外植體所包含的細胞，

c)通過將所述外植體的下胚軸或其部分插入到生長培養基中來將所述外植體轉移到所述生長培養基中，所述生長培養基包含針對所述選擇標記基因的至少一種選擇化合物，其中將所述外植體以向上的位置置于所述生長培養基中，

d)允許所述外植體形成枝條和／或允許該枝條伸長，所述枝條包含植物細胞，所述植物細胞包含含有所述選擇標記基因的所述至少一個植物表達盒的所述多核苷酸，和

e)從所述枝條再生轉基因植物。

2.權利要求1的方法，其中通過共培養所述外植體與包含T-DNA的農桿菌進行步驟b)，所述T-DNA包含含有所述選擇標記基因的至少一個植物表達盒的多核苷酸。

3.權利要求1的方法，其中步驟a)中的外植體來自6-10天齡幼苗。

4.權利要求2和3的方法，其中所述共培養允許轉化損傷的分生組織包含的細胞，以便獲得嵌合外植體。

5.權利要求1-4任一項的方法，其中所述方法還包括的步驟b1)，即將所述外植體轉移到枝條誘導培養基上，并在所述枝條誘導培養基上培養所述外植體。

6.權利要求1-4任一項的方法，其中在步驟b)后立即進行步驟c)。

7.權利要求1-6任一項的方法，其中在將所述外植體轉移到生長培養基中之后，在離體條件下培養所述外植體。

8.權利要求1-7任一項的方法，其中步驟e)包括以下步驟：

e1)從外植體分離步驟d)中獲得的伸長的枝條，

e2)將所分離的伸長的枝條轉移到生長培養基中，和

e3)從所述伸長的枝條再生轉基因植物。

9.權利要求1-7任一項的方法，其中在不從所述外植體分離伸長的枝條的情況下再生步驟e)中的轉基因植物。

10.權利要求1-9任一項的方法，其中步驟c)中的所述生長培養基是水培培養基，特別是其中所述水培培養基是基于甲醛或纖維素的泡沫。

11.權利要求1-11任一項的方法，其中所述選擇標記基因是突變的AHAS基因(乙酰乳酸合酶基因)，或針對D-氨基酸強加的毒性效應賦予抗性或增強的耐受性的標記基因，特別是編碼D-絲氨酸脫氨酶、D-氨基酸氧化酶，或D-丙氨酸轉氨酶的標記基因。

12.權利要求12的方法，其中所述選擇標記基因是突變的AHAS基因，并且其中所述選擇化合物是咪唑啉酮除草劑，特別是滅草煙。

13.權利要求1-13任一項的方法，其中所述植物是雙子葉植物，優選其中所述植物的屬選自大豆屬、苜蓿屬和菜豆屬，更優選其中所述植物是大豆。

14.用于產生轉基因植物的方法，其包括以下步驟：

(i)提供損傷的可轉化外植體，其包含至少一個子葉，和初生葉節或更高葉節的損傷的分生組織(特別是初生葉節或更高葉節的損傷的腋生分生組織)，

(ii)利用包含選擇標記基因的至少一個植物表達盒的多核苷酸轉化所述外植體所包含的細胞，

(iii)將所述外植體轉移到枝條誘導培養基中，并在所述枝條誘導培養基上培養所述外植體，所述枝條誘導培養基包含針對所述選擇標記基因的至少一種選擇化合物，由此允許包含植物細胞的至少一個從頭形成的枝條的形成，所述植物細胞包含所述選擇標記基因的所述至少一個植物表達盒，

(iv)分離包含所述至少一個從頭形成的枝條的所述初生葉節或更高葉節的分生組織，并將所述分生組織區轉移到水培培養基上，所述水培培養基包含針對所述選擇標記基因的至少一種選擇化合物，并允許所述至少一個從頭形成的枝條伸長，和

(v)從所述如此來源的小植株再生轉基因植物。

15.通過權利要求9的方法獲得的植物，特別是通過權利要求9的方法獲得的已經開花的植物。