[發明專利]無去污劑制備革蘭氏陰性細菌外膜泡囊的方法

在審

• 申請號: 201280033688.2
• 申請日: 2012-07-05
• 公開（公告）號: CN103687612A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: B·范德沃特比姆德;L·A·范德波爾
• 申請（專利權）人: 由衛生福利和體育大臣代表的荷蘭王國
• 主分類號: A61K39/095
• 分類號: A61K39/095;A61P39/04
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 張曉威

1.無去污劑制備在疫苗中使用的細菌外膜泡囊(OMV)的方法，所述方法包括以下步驟：

a)培養革蘭氏陰性細菌群落至靜止生長期；

b)在靜止生長期開始后至少約1小時的時間點，在調節至或具有高于pH8.0的pH、濃度為約1-100mM的金屬螯合劑的培養基中，孵育在a)中獲得的細菌，以提取OMV，所述金屬螯合劑優選為EDTA；以及

c)回收在b)中提取的OMV，其中所述回收至少包括從所述OMV移除所述細菌。

2.權利要求1的方法，其中所述革蘭氏陰性細菌具有基因修飾，所述基因修飾導致所述細菌產生毒性降低的LPS，但是所述LPS保留至少部分它的佐劑活性；所述基因修飾優選為降低或敲除一種或多種基因的表達的修飾，所述一種或多種基因選自lpxL1和lpxL2基因或其同源物和lpxK基因或其同源物，和/或所述基因修飾為引起一種或多種lpxE和/或pagL基因表達的修飾。

3.權利要求1或2的方法，其中在b)中，將所述細菌在所述培養基中孵育的靜止生長期開始后的所述時間點為約1-9小時，優選約2-5小時。

4.前述權利要求中任一項的方法，其中將所述OMV滅菌，優選通過過濾滅菌，優選使用具有小于約0.3微米小孔的濾器。

5.前述權利要求中任一項的方法，其中在步驟b)中，優選為EDTA的所述金屬螯合劑的濃度為約5-15mM，和/或其中所述pH為約pH7.5-pH9.5，優選約pH8.0-pH9.0，更優選約pH8.2-pH8.8，更優選約pH8.4-pH8.7。

6.前述權利要求中任一項的方法，其中a)中培養物的體積和/或b)中培養基的體積至少為約10L，更優選至少為約20L、40L、60L、80L、100L、200L、300L、400L、500L、800L、1500L、5000L、10,000L、20,000L或40,000L。

7.前述權利要求中任一項的方法，其中所述革蘭氏陰性細菌為奈瑟球菌屬(Neisseria)或博德特菌屬(Bordetella)的菌種，優選為腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria?meningitidis)或百日咳博德特菌(Bordetella?pertussis)。

8.前述權利要求中任一項的方法，其中所述革蘭氏陰性細菌具有一種或多種降低或敲除基因產物表達的突變，所述基因產物優選選自cps、包括lpxL1、rmpM、porA、porB和opA的脂質A生物合成基因產物。

9.前述權利要求中任一項的方法，其中所述革蘭氏陰性細菌表達多種porA亞型。

10.前述權利要求中任一項的方法，其中所述群落包含多于一種革蘭氏陰性細菌的菌株，并且其中每種菌株表達不同的porA亞型。

11.前述權利要求中任一項的方法，其中所述革蘭氏陰性細菌表達對所述革蘭氏陰性細菌而言外來的抗原。

12.前述權利要求中任一項的方法，其還包括將所述OMV與藥學可接受的賦形劑組合的步驟。

13.OMV，其可通過前述權利要求中任一項的方法獲得。

14.藥物組合物，其包含權利要求13的OMV和藥學可接受的賦形劑。

15.權利要求13的OMV或權利要求14的藥物組合物，其用作藥劑，其優選在腦膜炎的治療中用作藥劑。

16.在個體中誘發免疫反應的方法，所述免疫反應優選針對腦膜炎奈瑟球菌，所述方法包括向所述個體給藥權利要求13的OMV或權利要求14的藥物組合物。

17.權利要求13的OMV或權利要求14的藥物組合物在個體中誘發免疫反應的用途，所述免疫反應優選針對腦膜炎奈瑟球菌，所述用途包括向所述個體給藥權利要求13的OMV或者權利要求14的藥物組合物。