[發(fā)明專利]包含CSP-B 5’-SAR因子的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體及利用該載體的重組蛋白質(zhì)的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201280029037.6
• 申請(qǐng)日: 2012-05-21
• 公開（公告）號(hào): CN103797123A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高麗旭;李相瑢;金秀娟;文昇基
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 株式會(huì)社鐘根堂
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N5/10;C12N15/12
• 代理公司: 中國(guó)國(guó)際貿(mào)易促進(jìn)委員會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所 11038
• 代理人: 韓威威

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種包含CSP-B（Cytotoxic?Serine?Protease-B，細(xì)胞毒性絲氨酸蛋白酶-B）的5’-核骨架結(jié)合區(qū)（SAR，Scaffold?Attachment?Region）因子的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體及利用上述載體制備重組蛋白質(zhì)的方法。?

背景技術(shù)

若將對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行加密的外源基因?qū)肴缰袊?guó)倉(cāng)鼠卵（CHO，Chinese?Hamster?Ovary）細(xì)胞之類的動(dòng)物細(xì)胞，則可以生產(chǎn)用于臨床治療的蛋白質(zhì)醫(yī)藥品。?

作為紅細(xì)胞生長(zhǎng)因子的新型紅細(xì)胞生成刺激蛋白（NESP，Novel?Erythropoiesis?Stimulating?Protein）也被稱為達(dá)依泊汀α（Darbepoetin?alfa），它是以在天然型促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin）中生成兩個(gè)N-連接糖鏈部位的方式進(jìn)行基因操作的蛋白質(zhì)醫(yī)藥品（Egrie?and?Browne,Br.J.Cancer,84Suppl.1:3-10（2001））。新型紅細(xì)胞生成刺激蛋白刺激造血干細(xì)胞，促進(jìn)向紅細(xì)胞類的分化，從而增加紅細(xì)胞的生成。新型紅細(xì)胞生成刺激蛋白的血清半衰期相比于現(xiàn)有的重組促紅細(xì)胞生成素長(zhǎng)3倍，因此在慢性腎功能衰竭患者的貧血治療中，少量的給藥也能期待相同的治療效果。?

作為抗惡性腫瘤劑的曲妥珠單抗（Trastuzumab）是利用基因重組技術(shù)制備的人源化單克隆抗體（humanized?monoclonal?antibody），其選擇性地對(duì)存在于細(xì)胞表面的人表皮生長(zhǎng)因子受體2（Human??Epidermal?growth?factor?Receptor2，HER2）產(chǎn)生作用。在原發(fā)性乳腺癌的25～30％中確認(rèn)了人表皮生長(zhǎng)因子受體2的超表達(dá)，且曲妥珠單抗抑制由人表皮生長(zhǎng)因子受體2進(jìn)行超表達(dá)的人類腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。?

隨著外源基因向動(dòng)物細(xì)胞染色體的某個(gè)位置插入，外源基因?qū)⒕哂胁煌谋磉_(dá)率，這是因?yàn)椋鶕?jù)周邊的調(diào)節(jié)因子或染色質(zhì)（chromatin）的結(jié)構(gòu)，外源基因的表達(dá)會(huì)受到影響（Zahn-Zabal?et?al.,J.Biotechnol,87，29-42（2001））。?

若使用周圍的染色質(zhì)對(duì)外源基因的表達(dá)不產(chǎn)生影響的染色質(zhì)因子，就能克服基于這種位置的基因表達(dá)抑制現(xiàn)象（position?effect），提高能夠分離對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行高表達(dá)的動(dòng)物細(xì)胞克隆的機(jī)會(huì)，從而能夠縮短制備醫(yī)藥品生產(chǎn)細(xì)胞株的時(shí)間。正在試圖進(jìn)行使用能夠克服基于位置的基因表達(dá)抑制現(xiàn)象的染色質(zhì)因子，來(lái)制備穩(wěn)定的細(xì)胞株（stable?cell?line），而這些因子包含邊界元素（BE，Boundary?Element）、核骨架結(jié)合區(qū)或基質(zhì)結(jié)合區(qū)（SAR/MAR，Scaffold?or?Matrix?Attachment?Region）以及基因座控制區(qū)（LCR，Locus?Control?Region）等。?

SAR是一種也被稱為MAR的長(zhǎng)度為300～3000bp的DNA，其被認(rèn)為使染色體上的染色質(zhì)與核基質(zhì)（nuclear?matrix）的蛋白質(zhì)相結(jié)合，并調(diào)節(jié)基因的表達(dá)（（Makrides（Ed.）,Gene?Transfer?and?Expression?in?Mammalian?Cells.Elsevier.Chapter10（2003）），并且能夠在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株中提高外源基因的表達(dá)（Poljak?et?al.,Nucleic?Acids?Res,22,4386—4394（1994）；Kalos?and?Fournier,Mol.Cell.Biol,15,198-207（2005））。?

茨恩-嘉寶（Zahn-Zabal）等將雞溶菌酶（chicken?lysozyme）?5’-MAR向熒光素酶（lucif?erase）表達(dá)載體導(dǎo)入，并利用該載體對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，來(lái)制備了穩(wěn)定細(xì)胞（stable?cell）（Zahn-Zabal?et?al.,J.Biotechnol,87,29-42（2001））。當(dāng)與利用不包含MAR的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定細(xì)胞相比較時(shí)，利用包含溶菌酶5’MAR的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定細(xì)胞呈現(xiàn)更高的熒光素酶表達(dá)率。并且，相比于包含1副本的溶菌酶5’MAR的載體的情況，在包含2副本的載體的情況下呈現(xiàn)出更高的熒光素酶表達(dá)率。這種結(jié)果表明，向動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體導(dǎo)入MAR可以提高靶蛋白的表達(dá)率。?