[發明專利]發酵方法

無效

• 申請號: 201280028718.0
• 申請日: 2012-04-12
• 公開（公告）號: CN103620050A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: P.M.H.德霍泰;P.戈芬
• 申請（專利權）人: 葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C07K14/195;C07K14/34;A61K39/02
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 杜艷玲;王景朝

背景

本發明涉及用于產生重組蛋白的方法，具體是包括培養表達重組蛋白的宿主細胞和使宿主細胞成熟的步驟的用于產生重組蛋白的方法。本發明還提供了通過本發明的方法可獲得的重組蛋白，和包括所述重組蛋白的免疫原性組合物或疫苗。

某些毒素的表達已知是有挑戰性的，例如白喉毒素。DT可以通過純化來自白喉桿菌(Corynebacterium?diphtheriae)的培養物的毒素，隨后通過化學解毒產生，或者可以通過純化毒素的重組或遺傳解毒的類似物制成(例如CRM197，或US4,709,107、US5.846.711、US5,601,827和US5,917,017中描述的其它突變體)。

由于低蛋白豐度，用于疫苗中的白喉毒素例如CRM197的大量的產生已被阻礙。此問題先前已通過在大腸桿菌中表達CRM197(Bishai?等?J.?Bacteriol.?169:5140-5151)得以解決，Bishai?等描述了包含白喉毒素(包括tox信號序列)的重組融合蛋白的表達，這導致降解的蛋白的產生。

包含tox信號序列的白喉片段的克隆和這些序列在大腸桿菌中的表達涉及某些困難。表達的蛋白分泌到周質間隙并且此分泌伴隨宿主細胞的活力降低(O’Keefe?等?Proc.?Natl,?Acad.?Sci.?86:343-346)和重組蛋白的蛋白水解增加(Bishai等?J?Bacteriol.?169:5140-5151)。由于這些原因，已經暗示去除tox信號序列使得表達不再是在周質，這可以增加白喉類毒素的表達(Bishai等)。

PCT/EP2010/065047?(WO?2011/042516)首次公開了成功的CRM197的周質表達。這增加了CRM197的產量，但是即使如此，仍然可以進行對提取方法的改善以增加產量。Rathore公開了滲透壓程序的優化，用于在大腸桿菌中表達的蛋白產物的分離(Rathore?等Biotechnol.Prog.?2003,?19,?1541-1546)。Bochner等還公開了用于從宿主細胞回收周質蛋白的方法(US4680262)。

從而本發明提供了改善的用于產生重組多肽的方法，其包括使宿主細胞成熟的步驟，其中此步驟可以包括下列的任一或更多：

(1)?使宿主細胞接受pH休克；

(2)?孵育宿主細胞；或

(3)?冷凍宿主細胞。

此使宿主細胞成熟的步驟具有實質上增加蛋白提取效率的令人驚訝的結果。

簡要概述

在第一實施方案，提供了用于細菌類毒素的周質表達的方法，包括步驟：

a)?在發酵培養基中培養革蘭氏陰性宿主細胞的培養物，其中所述宿主細胞用多核苷酸轉化，并且其中所述多核苷酸編碼細菌類毒素和周質信號序列。

a(i))?誘導所述細菌類毒素的表達；

b)?使所述宿主細胞成熟，其中所述成熟步驟包括：

I)?使宿主細胞接受pH休克；

II)?無補料添加孵育所述宿主細胞；和/或

III)?使宿主細胞接受低于-20℃的溫度；和

c)?從所述宿主細胞提取細菌類毒素，其中所述提取方法包括滲透壓休克。

在第二實施方案，提供了用于細菌類毒素的周質表達的方法，包括步驟：

a)?提供包括在周質中表達的細菌類毒素的革蘭氏陰性宿主細胞；

b)?使所述宿主細胞成熟，其中所述成熟步驟包括：

I)?使宿主細胞接受pH休克；

II)?無補料添加孵育所述宿主細胞；和/或

III)?使宿主細胞接受低于-20℃的溫度；和

c)?從所述宿主細胞提取細菌類毒素，其中所述提取方法包括滲透壓休克。

在第三實施方案中，提供了通過本發明方法可獲得或通過本發明方法獲得的細菌類毒素。

在第四實施方案，提供包括本發明細菌類毒素和藥學可接受賦形劑的免疫原性組合物。

在第五實施方案，提供包括本發明免疫原性組合物的疫苗。

在第六實施方案，提供本發明的免疫原性組合物或疫苗在用于疾病的預防或治療的藥物的制造中的用途。

在第七實施方案，提供了預防或治療疾病的方法，包括向患者施用本發明的免疫原性組合物或疫苗。

附圖簡述