[發(fā)明專(zhuān)利]發(fā)酵方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201280028718.0
• 申請(qǐng)日: 2012-04-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103620050A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: P.M.H.德霍泰;P.戈芬
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12P21/00
• 分類(lèi)號(hào): C12P21/00;C07K14/195;C07K14/34;A61K39/02
• 代理公司: 中國(guó)專(zhuān)利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 杜艷玲;王景朝

1.?用于細(xì)菌類(lèi)毒素的周質(zhì)表達(dá)的方法，其包括步驟：

a)?在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)革蘭氏陰性宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中所述宿主細(xì)胞用多核苷酸轉(zhuǎn)化，并且其中所述多核苷酸編碼細(xì)菌類(lèi)毒素和周質(zhì)信號(hào)序列；

a(i))誘導(dǎo)所述細(xì)菌類(lèi)毒素的表達(dá)；

b)?使所述宿主細(xì)胞成熟，其中所述成熟步驟包括：

I)?使宿主細(xì)胞接受pH休克；

II)?無(wú)補(bǔ)料添加孵育所述宿主細(xì)胞；和/或

III)?使宿主細(xì)胞接受低于-20℃的溫度；和

c)?從所述宿主細(xì)胞提取細(xì)菌類(lèi)毒素，其中所述提取方法包括滲透壓休克。

2.?用于細(xì)菌類(lèi)毒素的周質(zhì)表達(dá)的方法，其包括步驟：

a)?提供革蘭氏陰性宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞用多核苷酸轉(zhuǎn)化，并且其中所述多核苷酸編碼細(xì)菌類(lèi)毒素和周質(zhì)信號(hào)序列并且其中所述革蘭氏陰性宿主細(xì)胞包括在周質(zhì)中表達(dá)的細(xì)菌類(lèi)毒素；

b)?使所述宿主細(xì)胞成熟，其中所述成熟步驟包括：

I)?使宿主細(xì)胞接受pH休克；

II)?無(wú)補(bǔ)料添加孵育所述宿主細(xì)胞；和/或

III)?使宿主細(xì)胞接受低于-20℃的溫度；和

c)?從所述宿主細(xì)胞提取細(xì)菌類(lèi)毒素，其中所述提取方法包括滲透壓休克。

3.?權(quán)利要求1或2的方法，其中所述pH休克包括使發(fā)酵培養(yǎng)基的pH升高或降低多于0.2個(gè)pH單位或多于0.5個(gè)pH單位或0.1-2.0個(gè)pH單位或0.2-1.0個(gè)pH單位。

4.?前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述孵育步驟包括孵育宿主細(xì)胞10分鐘-1年、10分鐘-6個(gè)月、10分鐘-12小時(shí)、10分鐘-6小時(shí)或10分鐘-2小時(shí)，任選地在20℃-40℃的溫度，例如23℃左右的溫度下。

5.?前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)包括使宿主細(xì)胞接受低于-20℃、-40℃、-60℃、-70℃或-80℃的溫度至少1小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、1天、2天或5天。

6.?前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)包括通過(guò)冷凍并然后融化宿主細(xì)胞的步驟。

7.?前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)包括：

-?使宿主細(xì)胞接受pH休克，隨后在無(wú)補(bǔ)料添加的條件下孵育宿主細(xì)胞；

-?在無(wú)補(bǔ)料添加的條件下孵育宿主細(xì)胞，隨后使宿主細(xì)胞接受pH休克；

-?在無(wú)補(bǔ)料添加的條件下孵育宿主細(xì)胞，隨后使宿主細(xì)胞接受低于-20℃的溫度；

-?使宿主細(xì)胞接受pH休克，隨后使宿主細(xì)胞接受低于-20℃的溫度；

-?使宿主細(xì)胞接受pH休克，隨后在無(wú)補(bǔ)料添加的條件下孵育宿主細(xì)胞，隨后使宿主細(xì)胞接受低于-20℃的溫度；或

-?在無(wú)補(bǔ)料添加的條件下孵育宿主細(xì)胞，隨后使宿主細(xì)胞接受pH休克，隨后使宿主細(xì)胞接受低于-20℃的溫度。

8.?前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述革蘭氏陰性宿主細(xì)胞選自大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和莫拉氏菌屬(Moraxella)。

9.?前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述革蘭氏陰性宿主細(xì)胞在步驟b)期間是活的。

10.?前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)菌類(lèi)毒素是白喉類(lèi)毒素，例如CRM197。

11.?權(quán)利要求1任一的方法，其中所述周質(zhì)信號(hào)序列是：

a)?任一SEQ?ID?NO:2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24或26；

b)?SEQ?ID?NO:?2、4、6、8、?10、12、14、18、20、22、24或26包含1、2或3個(gè)點(diǎn)突變、插入或缺失的變體；或

c)?SEQ?ID?NO:?2、4、6、8、?10、12、14、18、20、22、24或26的至少10個(gè)氨基酸的片段。

12.?前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括純化細(xì)菌類(lèi)毒素的步驟d)。