[發明專利]改良型腈水合酶

有效

• 申請號: 201280028405.5
• 申請日: 2012-05-30
• 公開（公告）號: CN103649312B
• 公開（公告）日: 2017-03-22
• 發明（設計）人: 渡邊文昭;安保貴永;原愛
• 申請（專利權）人: 三菱麗陽株式會社
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12N9/88;C12P13/02
• 代理公司: 北京林達劉知識產權代理事務所(普通合伙)11277
• 代理人: 劉新宇,李茂家

技術領域

本發明涉及改良型(變異型)的腈水合酶及其制造方法。進而涉及編碼該酶的基因DNA、包含該基因DNA的重組載體、和具有該重組載體的轉化體以及酰胺化合物的制造方法。

背景技術

近年發現了酶腈水合酶、即具有將腈基水合并轉換為酰胺基的腈水合活性的酶，公開了使用該酶或含有該酶的微生物菌體等通過腈化合物而制造對應的酰胺化合物的方法。已知該制造方法與現有的化學合成法相比較，由腈化合物向對應的酰胺化合物的轉化率和選擇率高。

作為生產腈水合酶的微生物，可列舉出例如：屬于棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)等的微生物。其中，玫瑰色紅球菌(Rhodococcus?rhodochrous)J1株用于丙烯酰胺的工業生產中，其有用性已被證實。另外，編碼該菌株所產生的腈水合酶的基因也已明確(參照專利文獻1)。

另一方面，不僅利用由自然界中存在的微生物分離的腈水合酶、其基因，還出于改變腈水合酶的活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩定性、對底物的穩定性、對生成物的穩定性等目的，嘗試了向腈水合酶中導入變異(參照專利文獻2)，本發明人等取得了使耐熱性或酰胺化合物耐性均提高了的腈水合酶基因(參照專利文獻3和4)。

但是，從催化劑成本等生產成本的觀點出發，開發耐熱性和酰胺化合物耐性更進一步提高、或在高溫下能夠反應的腈水合酶并用于酰胺化合物的制造是非常有用的；從反應時的酶量的削減和成本削減等觀點出發，期望開發而獲得具有這樣的性能的酶。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：日本專利第3162091號公報

專利文獻2：國際公開第2004/056990號小冊子

專利文獻3：國際公開第2005/116206號小冊子

專利文獻4：日本特開2007-143409號公報

發明內容

發明要解決的問題

因此，本發明的目的在于通過腈水合酶的改良，提供耐熱性、酰胺化合物耐性以及高溫累積性進一步提高了的具有腈水合酶活性的蛋白質。另外，本發明的目的在于提供編碼該蛋白質的基因DNA、包含該基因DNA的重組載體、包含該重組載體的轉化體、從該轉化體的培養物中提取的腈水合酶及其制造方法。進而，本發明的目的在于提供使用了該培養物或該培養物的處理物的酰胺化合物的制造方法。

用于解決問題的方案

本發明人等為了解決上述問題進行了深入的研究。結果發現，在野生型腈水合酶的氨基酸序列中將特定的氨基酸殘基置換為其他的氨基酸殘基而成的蛋白質不僅具有腈水合酶活性，耐熱性、酰胺化合物耐性和高溫累積性也提高了，至此完成本發明。

即，本發明如下。

(1)以下(A)或(B)的蛋白質；

(A)蛋白質，其特征在于，包含在野生型腈水合酶的氨基酸序列中下述(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的氨基酸殘基被置換為其他的氨基酸殘基、進而選自由下述(f)～(q)所組成的組的至少一個氨基酸殘基被置換為其他的氨基酸殘基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性；

(a)β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數167殘基下游的氨基酸殘基、

(b)β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數219殘基下游的氨基酸殘基、

(c)β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數57殘基下游的氨基酸殘基、

(d)β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數114殘基下游的氨基酸殘基、

(e)β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數107殘基下游的氨基酸殘基、

(f)β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數218殘基下游的氨基酸殘基、

(g)β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數190殘基下游的氨基酸殘基、

(h)β亞基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸殘基開始數168殘基下游的氨基酸殘基、