[發明專利]用于在真核生物中調控基因表達或檢測和控制DNA座位的構建體和方法

無效

• 申請號: 201280025347.0
• 申請日: 2012-03-23
• 公開（公告）號: CN103732752A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 克斯廷·拜斯特里奇;弗蘭克·加拉多;大衛·萊恩;耐莉·杜巴里
• 申請（專利權）人: 國家科研中心
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12Q1/25;C07K14/21;C07K19/00;C12N15/82
• 代理公司: 北京派特恩知識產權代理事務所(普通合伙) 11270
• 代理人: 張穎玲;孟桂超

技術領域

本發明總體上涉及生物技術領域，且尤其涉及在生物技術中有用的儀器的領域。

更具體地，本發明提出了來源于細菌質粒和染色體DNA的分離系統（partitioning?system）序列用于在真核細胞、尤其在活的真核細胞中調控基因表達，和/或在所述細胞中檢測和控制感興趣的基因組DNA座位的應用。

因此，本發明涉及在這些調控、檢測和控制方法中使用的構建體（諸如真核表達載體、融合蛋白和編碼該相同蛋白的寡核苷酸），及轉化有所述構建體或表達所述構建體的真核細胞。

本發明還涉及一種用于在真核細胞中調控基因表達的方法，及一種用于在真核細胞中檢測和控制感興趣的基因組DNA座位的方法。

背景技術

典型地，使用雙組分系統獲得體內基因組DNA座位的可視化，該雙組分系統包含被一蛋白（被稱為抑制因子（repressor））識別且被該蛋白特異性結合的DNA靶序列（被稱為操縱因子（operator））（Belmont,2001;Belmont&Straight,1998;Straight等,1996）。被稱作FROS（熒光的抑制因子-操縱因子系統）的該系統已經被常規用于在細菌的活細胞以及哺乳動物的細胞中檢測DNA區域的位置。

目前，僅有操縱因子/抑制因子類型的兩種系統（即LacO/LacI和TetO/TetR系統）可用于在真核生物中進行體內成像（Bystricky等,2005;Michaelis等,1997;Therizols等,2010）。

這些系統的不足之一在于操縱序列的大小和重復性。這種類型的操縱因子有效地由多于200個重復的細菌操縱序列組成。由于這個原因，在它現在的版本中，LacO操縱因子包含超過10kb的DNA。

即使該技術已經能夠進行體內DNA區域的可視化，這些龐大的序列的插入可能修飾染色質纖維的性能。此外，該大小的染色體區域的延伸和壓縮可能扭曲動態研究（諸如隨時間跟蹤熒光顆粒）的進行。

由于這個原因，在活細胞中對染色體的構造和動態學的研究大大受到操縱序列自身大小的限制。還沒有開發出用于真核生物的包含短的沒有重復的DNA序列的檢測技術。

因此，確實需要允許在真核細胞、特別是在活的真核細胞中研究染色體構造和動態學的系統和構建體。本發明人已經為自己制定了確定這樣的系統和這樣的構件的目標。

在細菌中有絲分裂的過程中染色體的分離或隔離經由包括以下三種單元（element）的系統出現：短的序列（被稱為ParS），與ParS結合的ParB蛋白，以及具有調動ParB-ParS復合體的ATPase活性的第二蛋白ParA（Lin&Grossman,1998）。在染色體上，ParS典型地以在復制起始區域內分布的少量拷貝的形式存在（Livny等,2007）。ParB特異地結合在ParS序列中存在的結合序列處。一旦結合，則ParB能夠通過它的N-端結構域招募自身的其它拷貝。此外，ParB以雙向方式散布在結合位點附近的DNA上（Murray等,2006;Lynch&Wang,1995）。大部分細菌種類包含單一的染色體及具有相同或幾乎相同的序列的ParS位點。

相反，細菌洋蔥伯克氏細菌（Burkholderia?cenocepacia，Bcc）包含三個染色體及具有低量拷貝的質粒，該質粒被稱為Par-c1（染色體1的分離系統）、Par-c2（染色體2的分離系統）、Par-c3（染色體3的分離系統）和Par-p1（質粒的分離系統）的特定分離系統獨立地分離。這四個復制子中的每一個均攜帶在大約1kb上分布的具有少量拷貝的特定序列parS（Dubarry等,2006）。在本文章中，通過諸如來源于pDAG203的質粒制備不同的質粒構建體，在該質粒構建體中已經插入了來源于Bcc的染色體或質粒parS序列。所述質粒被用于轉化細菌大腸桿菌（Escherichia?coli，E.coli）。但是，這些質粒不形成諸如下面限定的真核載體。