[發明專利]乙酰輔酶A 衍生出的化合物的生產

無效

• 申請號: 201280022308.5
• 申請日: 2012-05-09
• 公開（公告）號: CN103502428A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: A·梅多斯
• 申請（專利權）人: 阿邁瑞斯公司
• 主分類號: C12N1/12
• 分類號: C12N1/12
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 孫式洪

1.相關申請的交叉引用

本申請要求2011年5月9日提交的美國臨時專利申請號61/483,896的優先權，其通過引用并入本文。

2.技術領域

本公開內容涉及泛酸鹽(也被稱作維生素B5)作為非遺傳開關的用途，所述非遺傳開關用于調控遺傳修飾的宿主細胞的異源乙酰輔酶A衍生出的化合物的生產。

3.背景技術

合成生物學的出現已經帶來了用發酵微生物在工業規模和質量從可再生來源生產生物燃料、化學試劑和生物材料的希望。例如，已經在微生物宿主中成功地構建了功能性的非天然的生物途徑，用于生產：抗瘧疾藥青蒿素的前體(參見，例如，Martin等人,Nat?Biotechnol21:796-802(2003)；脂肪酸衍生出的燃料和化學試劑(例如，脂肪酸酯類、脂肪醇類和蠟類；參見，例如，Steen等人,Nature463:559-562(2010)；產生膽固醇降低藥物的聚酮化合物合酶(參見，例如，Ma等人,Science326:589-592(2009)；和聚酮化合物(參見，例如，Kodumal,Proc?Natl?Acad?Sci?USA101:15573-15578(2004)。但是，合成生物學的商業成功較大程度上取決于可再生產物的生產成本是否可以與它們各自的不可再生的相應物的生產成本競爭或勝過后者。

菌株穩定性可以是工業發酵成本的一個重要驅動器，因為它會影響可以生產性地運行連續發酵的時間長度。菌株穩定性通常表示，微生物在長培養時間內維持非分解代謝發酵產物的有利生產特征(即，高收率(克化合物/克底物)和生產力(克/升發酵液/小時))的能力。具體地，遺傳穩定性在產物的持續輸出中起重要作用，所述遺傳穩定性是生產微生物群的與產物生產有關的基因的預期等位基因頻率隨時間幾乎沒有至沒有改變的傾向。

對于除了生物質以外的產物(作為定義，所述產物會消耗代謝能和碳，所述代謝能和碳否則可用于生產更多的細胞)的非分解代謝發酵而言，不穩定性的基礎是雙重的：進化突變和選擇。首先，生產損失突變自發地和隨機地產生。其次，具有降低的產物收率的細胞的生長速率或“適合性”優點會導致低產者的最終群體掃蕩，并由此降低總培養物性能。該現象可以被稱作“菌株退化”。

長期以來，巴西燃料乙醇發酵會實現從糖至乙醇的極高收率，即，最大理論收率的約90%。這部分地歸因于乙醇的生產是分解代謝：它每生產1分子的糖產生2個ATP，且是在沒有涉及氧的情況下平衡的氧化還原。突變至不產生乙醇的細胞在發酵罐的低氧條件下不太適合，并且不會掃蕩群體。這允許工業乙醇發酵在整個季節中再循環大部分酵母生物質，由此使糖向酵母細胞生物質的轉化最小化，并將幾乎所有的糖導向乙醇生產。生物質的這種延長的繁殖和再使用會增加乙醇生產效率：因為在每個循環中更少的糖轉化成生物質而降低運行支出(即，收率增加)；和因為需要更少的和更小的發酵罐即可建立用于接種的生物質而降低資本支出。

相反，許多乙酰輔酶A衍生出的烴類(例如，類異戊二烯類、脂肪酸類和聚酮化合物類)的生產在性質上通常是非分解代謝；它們通常需要ATP、NADPH和碳的凈輸入，經常需要大量供氧以幫助平衡該系統的氧化還原。這樣的環境會使朝向更低產物、更高生物質生產的基因型的進化更有利，并導致更高的菌株退化速率。

降低生產非分解代謝產物的負選擇壓力的一種途徑是，在不期望產物的階段，例如在必須產生生物質以使發酵罐生產力最大化的發酵階段，關閉產物形成。遺傳開關是在實踐中實現該目的的一種常見方式，但是可能由于下述原因而具有缺點：例如，外源性誘導物的成本，轉錄和翻譯該開關的延遲，并且如果突變發生在遺傳開關本身中，也可以是低產者的源頭。但是，代謝開關不具有這些缺點。

因而，本領域需要可以在發酵過程中控制乙酰輔酶A衍生出的化合物的生產時機的代謝開關。

4.發明內容

本文提供了一種從遺傳修飾的宿主細胞生產異源乙酰輔酶A衍生出的化合物(“HACD化合物”)的發酵方法。在某些實施方案中，所述方法包括2個階段：建立階段，其中HACD化合物生產大幅下降(“關閉”階段)，而積累細胞生物質；和生產階段。其中開啟HACD化合物生產。因而，在不需要生產的發酵階段中，會減輕與HACD化合物生產有關的負選擇壓力。不受理論的約束，據信，HACD化合物生產在建立階段中的減少或消除會導致所述菌株在生產階段中的穩定性提高，從而導致更持久的HACD化合物生產，由此增加菌株的總收率和/或生產力。發酵培養物中HACD化合物生產的“關閉”和“開啟”狀態受培養基中的乙酰輔酶A前體泛酸鹽的量控制。