[發明專利]用于從疫苗離析和量化抗原的方法

有效

• 申請號: 201280018905.0
• 申請日: 2012-04-18
• 公開（公告）號: CN103502263A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 米歇爾·格蘭因戈爾;馬丁·卡利沃達
• 申請（專利權）人: 巴克斯特國際公司;巴克斯特醫療保健股份有限公司
• 主分類號: C07K14/005
• 分類號: C07K14/005;C12N7/00;G01N33/68
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 張穎;謝麗娜

相關申請

本申請要求2011年4月21日提交的序列號61/477,835的美國臨時專利申請的權益，該臨時申請以引用的方式整體并入本文。

領域

本公開通常涉及疫苗領域及用于在沒有已知標準品的情況下離析和測量疫苗中的抗原含量的方法。

背景

流感病毒基于其核蛋白抗原和基質蛋白抗原之間的抗原性差異通常分為三類：A、B和C。取決于兩種主要病毒表面糖蛋白：血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的抗原性質，流感病毒進一步分為亞型。HA和NA均攜帶抗原表位。產生針對HA和NA的抗體與抵抗人類和動物中的感染和/或疾病相關聯。針對流感接種疫苗的功效很大程度上由疫苗中的免疫原性HA的量來決定。因此，A型和B型流感病毒的主要的抗原決定簇是HA而對流感接種疫苗的功效很大程度上由疫苗中的免疫原性HA的量即抗原含量來決定。

迄今為止，抗原含量用世界衛生組織合作中心(以下稱為“WHO”)提供的國際標準品來測量，其用于測定抗原值例如疫苗的HA含量。然而，通常，當標準品不可用時，例如當病毒抗原的不同季節菌株存在抗原性差異(即較低同源性)或當存在病毒的大流行爆發而對于其尚無可用標準品時，疫苗由疫苗制造商制備。

這種大流行病爆發發生在2009年4月，當墨西哥、美國和幾個其它國家中A型流感/加利福尼亞/07/2009?H1N1大流行病爆發時，組合來自人類、豬和禽流感的基因的新型流感菌株進化，最初稱為“豬流感”。在此特定的情況下，在WHO具有用于H1抗原的可用標準品之前，需要疫苗。在2009年9月，美國食品和藥品管理局批準了針對2009年H1N1流感病毒的四種疫苗。然而在開發這些疫苗的時候，仍然沒有可用的WHO標準品來量化新疫苗中的HA。

數十年來，已經使用具有由世界衛生組織(WHO)合作中心提供的國際標準品的單向輻射免疫擴散(SRID或SRD)對流感疫苗的HA含量進行了測定。這些國際標準用于測定抗原值例如疫苗的HA含量。在SRID中，流感病毒顆粒被去污劑破壞，并且被呈遞使其在載有抗體的瓊脂糖凝膠中在室溫下免疫擴散三天。在凝膠染色時，測量抗原-抗體復合物的沉淀區域的直徑，并且通過使用用具有已知HA含量的這種亞型的整個病毒參考批次獲得的校準曲線，計算某亞型的病毒制劑的抗原含量。然而，SRID是費力且低通量的測定法。此外，特別對于未經純化的(過程中的)流感病毒，靈敏度、準確度和精確度相對較低。

Kapteyn等(Vaccine?24:3137-44,2006；“Kapteyn”)公開了用于量化流感病毒培養中的HA以及用于鑒定來自三價疫苗中的單個流感菌株的HA的RP-HPLC測定法。然而，Kapteyn的方法不在沒有標準品的情況下量化HA。另外，Kapteyn使用去污劑溶解抗原和烷基化以防止具有活性巰基基團的蛋白質重新結合并形成復合物。實際上，在Kapteyn的方法中，HA通過使用強去污劑溶解膜而被完全離析。Kapteyn的方法也沒有被描述適于量化來自福爾馬林滅活的流感菌株的HA。

因此，迄今為止本領域沒有公開用于準確地和有效地測定粗制或純化HA樣品中的HA抗原濃度的方法，特別是在不用去污劑或烷基化試劑處理的樣品中以及在缺少由WHO合作中心提供的HA蛋白標準品下。顯然，在可從WHO合作中心得到抗原標準品之前，在本領域中非常需要用于在疫苗制造中可靠離析和量化包括病毒抗原諸如HA抗原的抗原的穩健、準確和快速的方法。下面的公開描述了此類方法的詳情。

概述

開發本文描述的方法以在缺乏可用抗原標準品的情況下提供測量疫苗中的抗原含量的裝置。因此，本發明解決本領域中涉及在不需要國際標準品的情況下、在疫苗開發和制造過程期間快速和準確量化疫苗中的抗原濃度的一個或多個需要。因此，本文提供的方法允許疫苗制造商在不等待WHO開發和提供標準品的情況下更快地生產疫苗，該疫苗可以被傳遞給公眾。

更具體地說，本發明在不使用標準品的情況下提供離析和準確量化疫苗抗原的快速和穩健方法，其是準確且可重復的。本公開適于用于各種抗原，由此在迄今為止疫苗制造的領域中提供改進方法。

本發明提供了用于從疫苗組合物離析抗原的方法，該方法包括以下步驟：(a)在沒有去污劑和沒有烷基化試劑的情況下溶解疫苗組合物中的抗原；和(b)通過分級分離離析抗原或抗原亞型。