[發明專利]對轉基因邊界的高通量分析

有效

• 申請號: 201280015927.1
• 申請日: 2012-03-30
• 公開（公告）號: CN103476950A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 曹澤暉;S.諾瓦克;周寧
• 申請（專利權）人: 陶氏益農公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12P19/34
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張文輝

發明領域

一般而言，本發明涉及植物分子生物學和生物化學領域。本發明關注用于分析轉基因邊界及測定在轉基因側翼的染色體序列的改良的聚合酶鏈式反應(PCR)方法。

發明背景

測定與插入轉基因相鄰的染色體側翼序列和基因組位置在技術上是挑戰性的。已經開發出多種方法來克服鑒定在已知DNA序列側翼的未知DNA序列的限制。然而，這些用于鑒定在已知轉基因側翼的基因組染色體序列的傳統PCR方法諸如LM-PCR(又稱為基因組步移(Genome?Walking))和其它方法(包括：反向PCR(i-PCR)、熱不對稱交錯PCR(TAIL-PCR)、錨式PCR(a-PCR)和隨機引發(randomly?primed)PCR(rm-PCR))由于制備過程中的DNA損失而受到低檢測靈敏性(需要大量模板DNA)或低特異性阻礙。

聚合酶鏈式反應(PCR)是一種通常采用的分子生物學方法。該方法如下實施：使雙鏈模板DNA變性，將寡核苷酸引物與DNA模板退火，并經由DNA聚合酶延伸DNA鏈。寡核苷酸引物設計為與DNA的相反鏈退火，并且定位為使得由DNA聚合酶生成的DNA鏈充當另一引物的模板鏈。重復每個循環，導致DNA片段的指數擴增。(Mullis等,美國專利No.4,683,195,4,683,202,及4,800,159)。本領域技術人員使用PCR對于擴增和分離DNA片段以進行后續分析是基本的。

經由聚合酶鏈式反應(PCR)分離和分析DNA模板要求側翼DNA序列的知識。不幸的是，此要求限制對已知DNA序列區域的PCR擴增。使用PCR方法鑒定轉基因位置在基因組內的位置受到轉基因對生物體基因組內未知染色體位置的隨機插入阻礙。鑒定與已知DNA序列相鄰定位的未知DNA序列的方法對于鑒定生物體染色體內的轉基因位置是必要的。另外，可以使用此類方法鑒定新穎的基因序列，從而鑒定新性狀，測定已經插入生物體的基因組中的轉座子或病毒序列的基因組位置，或者鑒定經由插入誘變插入基因組中的多核苷酸序列的染色體位置。

已經開發出多種方法來克服在已知DNA序列側翼的未知DNA序列的限制。連接介導的PCR(LM?PCR)方法(其中生成基因組文庫，并將銜接頭與DNA片段退火以進行PCR擴增)以GENOME?WALKER?UNIVERSAL?KITTM(參見美國專利No.5,565,340,及美國專利No.5,759,822)銷售。常用的另一種方法是反向PCR反應(參見Silver?and?Keerikatte(1989),J.Virol.,63:1924-1928)，其中將DNA用限制酶消化，并自身連接，生成連續環。使用結合已知序列的寡核苷酸引物的PCR擴增導致未知側翼序列的擴增和闡明。不幸的是，這些方法是效率低的且費時的。這些和其它傳統PCR法(包括熱不對稱交錯PCR[TAIL-PCR]、錨式PCR[a-PCR]和隨機引發PCR[rm-PCR])由于制備過程中的DNA損失而受到低檢測靈敏性(需要大量模板DNA)或低特異性阻礙。

可以通過純化含有已知的和未知的DNA序列兩者的染色體DNA片段來改善檢測靈敏性的方法的開發可以產生用于檢測和表征與已知DNA序列相鄰定位的未知DNA區的靈敏方法。線性擴增介導的聚合酶鏈式反應(LAMPCR)方法的開發實現這些目的。參見美國專利No6,514,706。LAM?PCR法特別適合于擴增和分析其序列僅部分已知的DNA片段。

可以通過純化含有已知的和未知的DNA序列兩者的染色體DNA片段來改善檢測靈敏性的方法的開發可以產生用于檢測和表征與已知DNA序列相鄰定位的未知DNA區的靈敏方法。LAM?PCR法的開發實現這些目的。LAMPCR是一種用于分析與已知DNA序列相鄰定位的未知染色體側翼序列的改良PCR方法。可以使用LAM?PCR法來將在已知DNA或RNA區側翼的未知DNA或RNA序列鑒定和/或測序。