[發明專利]對轉基因邊界的高通量分析

有效

• 申請號: 201280015927.1
• 申請日: 2012-03-30
• 公開（公告）號: CN103476950A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 曹澤暉;S.諾瓦克;周寧
• 申請（專利權）人: 陶氏益農公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12P19/34
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張文輝

1.一種用于在分離的DNA中尋找與已知的多核苷酸序列相鄰的未知多核苷酸序列的方法，其包括：

a)用一種或多種合適的限制酶消化含有部分或整個的所述已知多核苷酸序列和相鄰的未知多核苷酸序列的所述分離的DNA以生成多個經消化的多核苷酸限制性片段；

b)使用寡核苷酸引物序列合成所述經消化的多核苷酸限制性片段的互補鏈，所述寡核苷酸引物序列具有與所述寡核苷酸引物序列的5’端結合的附接化學；

c)通過將所述附接化學與合適的分離基質結合，然后使所述互補鏈變性從所述經消化的多核苷酸限制性片段分離所述互補鏈；

d)將單鏈銜接頭與結合到所述分離基質的分離的互補鏈連接以生成連接的分離的互補鏈；

e)使用第一PCR引物和第二PCR引物對所述連接的分離的互補鏈實施第一PCR擴增以生成第一PCR擴增子，所述第一PCR引物設計為結合已知的多核苷酸序列，所述第二PCR引物設計為結合所述單鏈銜接頭；

f)對所述第一PCR擴增子實施第二PCR擴增以生成第二PCR擴增子，其中所述第二PCR擴增擴增所述第一PCR擴增子的內部序列；并

g)對所述第二PCR擴增子測序以確認所述未知多核苷酸序列的序列。

2.權利要求1的方法，其中所述分離的DNA是植物基因組DNA。

3.權利要求1的方法，其中所述未知多核苷酸序列是轉基因邊界序列。

4.權利要求1的方法，其中所述未知多核苷酸序列是在已知多核苷酸序列側翼的染色體序列。

5.權利要求1的方法，其中所述未知多核苷酸序列是編碼性狀的天然基因序列。

6.權利要求1的方法，其中所述已知多核苷酸序列是已知多核苷酸病毒序列。

7.權利要求1的方法，其中所述已知多核苷酸序列是已知多核苷酸轉基因序列。

8.權利要求1的方法，其中所述已知多核苷酸序列是已知多核苷酸轉座子序列。

9.權利要求1的方法，其中所述已知多核苷酸序列是編碼性狀的基因序列。

10.權利要求1的方法，其中使用所述方法鑒定經由插入誘變插入分離的植物DNA中的已知多核苷酸序列的染色體位置。

11.權利要求10的方法，其中所述插入誘變選自下組：轉座子誘變、或T鏈整合誘變。

12.權利要求1的方法，其中使用所述方法表征由在已知多核苷酸序列側翼的染色體序列組成的未知多核苷酸序列。

13.權利要求12的方法，其中對轉基因插入位點的所述表征鑒定由在由染色體序列組成的所述未知多核苷酸序列內的重排、插入、缺失、或倒位組成的多核苷酸序列。

14.權利要求1的方法，其中使用所述方法測定轉基因拷貝數。

15.權利要求1的方法，其中使用所述方法鑒定轉基因植物系。

16.權利要求1的方法，其中使用所述方法開發分子標志物系統。

17.權利要求17的分子標志物系統，其用于加速育種策略。