[發明專利]回收植物來源的蛋白質的方法

在審

• 申請號: 201280014186.5
• 申請日: 2012-03-23
• 公開（公告）號: CN103502261A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 馬農·科圖雷;達尼·帕克特;路易斯-菲利普·韋齊納
• 申請（專利權）人: 麥迪卡格公司
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C07K14/415;C12N15/00;C12N15/82
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 彭鯤鵬;盧蓓

技術領域

本發明涉及回收植物來源的蛋白質的方法。更具體地,本發明提供從植物和植物組織獲取蛋白質(包括蛋白超結構(suprastructure))的方法。

背景技術

目前宿主細胞(例如大腸桿菌、昆蟲細胞培養物和哺乳動物細胞培養物)中的重組表達策略在培養基中以非常高的水平表達和分泌蛋白質。使用這些系統獲得了高水平表達、正確蛋白質折疊和蛋白質翻譯后修飾。此外,由于可以容易地將細胞內蛋白質與其他組分(DNA、囊泡、膜、色素等)分離,所表達蛋白質的純化得以簡化。對于植物或酵母表達系統,細胞壁阻止表達的蛋白質分泌到培養基中。

廣泛使用不同的科學方法來產生細胞提取物。對于某些類型的蛋白質或細胞組分,通常不選擇機械方法來破壞細胞壁并釋放其內容物。將目的蛋白質直接表達入細胞培養基,使得能夠通過離心或過濾去除細胞內雜質,從而使目的蛋白質被簡單快速地富集。還可期望在將目的蛋白質或蛋白超結構用于疫苗配制之前,從存在于植物或植物物質中的一些或全部蛋白質、DNA、膜片段、囊泡、色素、碳水化合物等中分離目的蛋白質或蛋白超結構,包括蛋白花環(protein?rosette)、納米顆粒、大蛋白復合物、抗體或病毒樣顆粒(virus-like?particle,VLP)等等。

免疫球蛋白(IgG)是對多種性質的特定抗原性對應物有特征性親和力的復雜異多聚體蛋白質。當今IgG產生細胞系的常規分離和IgG定向進化和分子改造技術的出現極大地影響了它們作為生物治療劑和在一般生命科學應用中的改進。治療性單克隆IgG(單克隆抗體,mAb)在目前的新抗炎藥和抗癌藥市場中占主導地位,并且目前正在對數百種新候選藥物進行研究和臨床開發以獲得改進的或新的應用。每年mAb的市場需求從幾克(診斷)、幾千克(抗毒素)到一百或數百千克(生物防護、抗癌、抗感染、抗炎)。WO2008／151440(通過引用并入本文)描述了從植物生產經修飾的糖蛋白的方法。

PCT公開WO00／09725(Turpen等)描述了一種從植物細胞間間隙提取蛋白質的方法,其包括真空和離心處理以提供包含目的蛋白質的間質液(interstitial?fluid)提取物。該方法適于能在真空和離心條件下通過微纖維網格的小蛋白質(50kDa或更小),但不適于較大蛋白質、超結構蛋白(superstructure?protein)、蛋白花環、納米顆粒、大蛋白復合物例如抗體或VLP。

1999年McCormick等(Proc?Natl?Acad?Sci?USA96：703-708)公開了使用與單鏈Fv(scFV)表位融合的大米淀粉酶信號肽將表達的蛋白質靶向到細胞外部分(compartment),隨后通過對葉和莖組織進行真空過濾來回收scFv多肽。2008年Moehnke等(Biotechnol?Lett30：1259-1264)描述了使用McCormick的真空過濾法通過質外體提取從煙草中獲得重組植物過敏原。PCT公開WO2003／025124(Zhang等)公開了在植物中表達scFv免疫球蛋白,其通過鼠信號序列靶向質外體空間。

病毒樣顆粒(VLP)可用于制備疫苗,例如流感疫苗。超結構(例如VLP)模擬病毒衣殼結構,但缺少基因組,從而不能復制或提供再次感染。VLP刺激強免疫應答,為分離(可溶)的重組抗原提供了改進的替代方法。VLP在特定病毒蛋白表達后進行組裝并具有類似于其同類病毒的外表面,但不同于真的病毒顆粒,遺傳物質不會整合到其中。與天然病毒類似的顆粒狀多價結構抗原的呈遞引發具有均衡的體液和細胞成分的增強的免疫應答刺激。認為優于分離抗原產生之刺激的這種改進對于包膜病毒尤其適用,因為包膜VLP以其天然膜結合狀態呈遞表面抗原(Grgacic和Anderson,2006年,Methods40,60-65)。此外,已證明與重組血凝素HA(即單體HA,或組成花環的HA；3-8個三聚體的HA組裝物)相比,擁有納米顆粒組織結構的流感VLP是更佳的候選疫苗,并且他們能激活體液和細胞免疫應答。(Bright,R.A.,等,2007,Vaccine25,3871-3878)。

之前WO2009／009876和WO2009／076778的發明人已描述了包含脂質包膜的流感HA?VLP的生產(D'Aoust等；兩者均通過引用并入本文)。對于包膜病毒,病毒保留脂質層或膜可以是有利的。不同系統的脂質構成可以有所不同(例如植物生成的包膜病毒會在包膜中包含植物脂質或植物甾醇),這可有助于增強免疫應答。