[發明專利]生產能夠水解葉綠素或葉綠素衍生物的重組酶的方法

無效

• 申請號: 201280010050.7
• 申請日: 2012-02-16
• 公開（公告）號: CN103797114A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: S.M.馬德赫
• 申請（專利權）人: 杜邦營養生物科學有限公司
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;A23K1/165;C12N15/80;C12R1/885
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 鄒雪梅;李炳愛

技術領域

本發明涉及能夠水解葉綠素和葉綠素衍生物的酶的生產。?

背景技術

葉綠素是一種綠色色素，其廣泛發現于整個植物界，多存在于藻類和藍藻細菌中。葉綠素是光合作用所必需的，并且是地球上發現的最豐富的有機金屬化合物之一。因而許多來自植物的產品(包括食物和飼料)含有相當多的葉綠素。?

例如，得自含油種子(例如大豆、棕櫚種子或油菜籽(卡諾拉油菜)、棉籽、葵花籽、葡萄籽和花生)的植物油通常含有一些葉綠素。然而，通常不期望植物油中存在高含量的葉綠素色素。這是因為葉綠素使油帶上難看的綠色，并且在儲存期間可引起油的氧化，從而導致油的變質。?

已采用各種方法以除去植物油中的葉綠素。在產油過程的多個階段，包括種子破碎、油萃取、脫膠、堿處理和漂白步驟，都可除去葉綠素。然而，漂白步驟通常對于將葉綠素殘留量降至可接受含量是最為有效的。在漂白期間，加熱油并使其通過吸附劑以除去葉綠素和影響成品油外觀和/或穩定性的其他有色化合物。用于漂白步驟的吸附劑通常為粘土。?

在可食用油加工行業中，采用上述步驟通常會將加工油中的葉綠素含量降至介于0.02至0.05ppm之間。然而，漂白步驟由于漂白粘土的夾帶作用會增加加工成本和降低油產量。粘土的使用可能會將許多有用的化合物(例如類胡蘿卜素和生育酚)也從油中除去。另外粘土的使用也很昂貴，這尤其是因為用過的粘土(即廢料)的處理困難、危險(易于自燃)，因而處理成本高。因而已進行了用其他辦法從油中除去葉綠素的嘗試，例如使用葉綠素酶。?

在植物中，葉綠素酶(chlorophyllase或chlase)被認為參與葉綠素降解，并催化葉綠素中酯鍵的水解而生成脫植基葉綠素和葉綠醇。WO?2006009676描述了可降低組合物中葉綠素污染的一種工業方法，例如用葉綠素酶處理植物油。此方法中產生的水溶性脫植基葉綠素也是綠色，但是可通過水萃取法或二氧化硅處理除去。?

葉綠素通常在用于產油的種子中以及從種子提取油的過程中部分降解。一種常見的修飾為卟啉(二氫卟酚)環失去鎂離子形成稱為脫鎂葉綠素的衍生物(參見圖1)。卟啉環上高極性鎂離子的丟失導致脫鎂葉綠素與葉綠素相比在理化性質上顯著不同。通常在加工過程中，油中的脫鎂葉綠素比葉綠素含量更豐富。脫鎂葉綠素呈淡綠色，可通過與用于葉綠素類似的方法從油中除去，例如WO?2006009676中所述通過由具有脫鎂葉綠素酶活性的酶催化的酯酶反應。在某些條件下，一些葉綠素酶能夠水解脫鎂葉綠素以及葉綠素，因此適于除去這兩種污染物。脫鎂葉綠素水解的產物為紅色/褐色的脫鎂葉綠酸和葉綠醇。脫鎂葉綠酸也可由脫植基葉綠素(即葉綠素水解之后)失去鎂離子生成(參見圖1)。WO?2006009676教導了通過與脫植基葉綠素類似的方法(例如通過水萃取法或二氧化硅吸附)除去脫鎂葉綠酸。?

脫鎂葉綠素還可通過含油種子收獲和儲存期間植物酶的活性或者通過精制油期間的加工條件(即熱)進一步降解為焦脫鎂葉綠素(參見“Behaviour?of?Chlorophyll?Derivatives?in?Canola?Oil?Processing”，JAOCS，Vol，no.9(Sept.1993)pages?837-841(“卡諾拉油加工過程中葉綠素衍生物的行為”，《美國油脂化學協會雜志》，第9卷，1993年9月，第837-841頁))。一種可能的機制是脫鎂葉綠素碳環上甲酯鍵的酶水解，然后不穩定中間體向焦脫鎂葉綠素的非酶轉化。據報道來自藜(Chenopodium?album)的名為脫鎂葉綠酸酶的28-29kDa酶能夠催化脫鎂葉綠酸上類似的反應，以產生不含葉綠醇的焦脫鎂葉綠素衍生物，稱為焦脫鎂葉綠酸(參見圖1)。焦脫鎂葉綠酸比脫鎂葉綠酸極性低，導致焦脫鎂葉綠酸與脫鎂葉綠酸相比具有降低了的水溶解度和增加了的油溶解度。?