[發(fā)明專(zhuān)利]一種分離純化胰蛋白酶的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210598017.2
• 申請(qǐng)日: 2012-12-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103060297A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉冠男;王議鋒;劉翠珍;宋超龍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 青島九龍生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/76
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/76
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及純化胰蛋白酶的方法。

背景技術(shù)

胰蛋白酶原的分子量約為24000，其等電點(diǎn)約為pH8.9，胰蛋白酶的分子量與其酶原接近(23300)，其等電點(diǎn)約為pH10.8，最適pH7.6～8.0，在pH＝3時(shí)最穩(wěn)定，低于此pH時(shí)，胰蛋白酶易變性，在pH＞5時(shí)易自溶；Ca²⁺離子對(duì)胰蛋白酶有穩(wěn)定作用。

胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對(duì)于由堿性氨基酸(精氨酸、賴(lài)氨酸)的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專(zhuān)一性。此外還能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專(zhuān)一性仍表現(xiàn)為對(duì)堿性氨基酸一端的選擇。

胰蛋白酶作為蛋白酶的一種，不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，在決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。

此外還有抗炎癥作用。臨床上用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷、瘺管等所產(chǎn)生的局部水腫、血腫及膿腫等。還可用于治療毒蛇咬傷，也常用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)前對(duì)組織的處理。

用傳統(tǒng)的方法僅提取胰蛋白酶是相當(dāng)困難的。2006年7月上海阿敏制藥有限公司公開(kāi)了一種糜胰蛋白酶的制備方法(200610023582.0)，其采用低溫酸提、梯度鹽析、冰水透析、親和層析、乙醇醇析的產(chǎn)品工藝，得到糜胰蛋白酶。2011年1月馬忠仁等申請(qǐng)了一種提取糜胰蛋白酶的方法(200910170682.X)，其采用了CaCl₂激活糜胰蛋白酶原成為糜胰蛋白酶的同時(shí)加入飽和度的(NH₄)₂SO₄，使其生成硫酸鈣沉淀吸附糜胰蛋白酶，經(jīng)過(guò)洗脫、鹽析、超濾和凍干獲得白色的糜胰蛋白酶的凍干粉末。產(chǎn)品均為糜胰蛋白酶，沒(méi)有單純的胰蛋白酶提取分離純化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是將提取的胰蛋白酶純化，得到較高純度的胰蛋白酶。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明成本低，產(chǎn)品胰蛋白酶效價(jià)高，適合于規(guī)模化生產(chǎn)。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：將胰蛋白酶粗品溶解后，經(jīng)鹽溶、鹽析，再用活性胰蛋白酶激活，被激活的酶溶液再經(jīng)結(jié)晶透析、凍干的方法，即可得較高純度的胰蛋白酶，包括如下步驟：

(1)投料：稱(chēng)取胰蛋白酶粗品，按每克胰蛋白酶粗品加2～4ml的水?dāng)嚢枞芙猓{(diào)節(jié)pH至3.0±0.5，以助其溶解，攪拌10～16小時(shí)；計(jì)量溶液體積，按400～500g/L比例加入固體硫酸銨，待其溶解后，靜置沉淀10～16小時(shí)；

(2)鹽溶：將溶液過(guò)濾，稱(chēng)量濾餅重量，先按每克濾餅加入2^-4ml的水，攪拌溶解后，調(diào)節(jié)pH至3.0±0.4，再按每克濾餅加入1～3ml的飽和硫酸銨溶液靜止沉淀10～16小時(shí)；

(3)鹽析：將溶液過(guò)濾，量取濾液體積，加入等體積量的飽和硫酸銨溶液，靜置沉淀10～16小時(shí)；

(4)洗鎂：將上清液棄去，沉淀物真空抽濾，并在濾餅上加入飽和硫酸鎂溶液，靜置1分鐘，抽濾，待濾液開(kāi)始流出，將漏斗上剩余的硫酸鎂溶液傾去，將濾餅取出稱(chēng)重，待活化；

(5)活化：稱(chēng)濾餅重量為A千克，將濾餅溶于3A～5A升的0.001～0.01mol/L鹽酸溶液，另加入0.5～2mol/L氯化鈣溶液A～3A升及pH7.5～8.5硼酸緩沖液4A～6A升，再加入6A～9A升的水，調(diào)節(jié)pH至7.0～8.0，最后每克濾餅加5～15mg的結(jié)晶胰蛋白酶進(jìn)行活化，將溶液置0～10℃中靜置60～80小時(shí)進(jìn)行活化，pH控制在7.0～8.0；

(6)除鈣：活化后的溶液，調(diào)節(jié)pH至3.0±0.4，再按200～300g/L加入固體硫酸銨，攪拌溶解，在0～10℃中存放32～60小時(shí)使硫酸鈣沉淀，過(guò)濾，濾液按150～250g/L加入固體硫酸銨，在0～10℃中靜置10～14小時(shí)，過(guò)濾，得濾餅；

(7)結(jié)晶：按每克濾餅加入1～2ml?pH8.0～10.0硼酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH至8.0±0.4，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，0～10℃時(shí)浸于外透液中，結(jié)晶3～7天；

(8)透析：取出結(jié)晶液過(guò)濾得結(jié)晶物，再按每克結(jié)晶物加入1～3ml水溶解，調(diào)節(jié)pH至3.0±0.5；將溶液透析2～4天，去除雜質(zhì)，每10～14小時(shí)左右透析池?fù)Q水一次，溫度控制在0～10℃；

(9)凍干：取出透析液，加入少量硅藻土，抽濾，得濾液，調(diào)節(jié)pH至6.0±0.4，進(jìn)凍干機(jī)凍干后得結(jié)晶胰蛋白酶成品。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：

實(shí)施例1