[發明專利]一種分離純化胰蛋白酶的方法

有效

• 申請號: 201210598017.2
• 申請日: 2012-12-28
• 公開（公告）號: CN103060297A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 劉冠男;王議鋒;劉翠珍;宋超龍
• 申請（專利權）人: 青島九龍生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種分離純化胰蛋白酶的方法，其特征在于：將胰蛋白酶粗品溶解后，經鹽溶、鹽析，再用活性胰蛋白酶激活，被激活的酶溶液再經結晶透析、凍干，即可。

2.根據權利要求1分離純化胰蛋白酶的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

(1)投料：取胰蛋白酶粗品，加水溶解，調節pH，攪拌；加入硫酸銨，溶解，靜置；

(2)鹽溶：過濾，濾餅加水，攪拌溶解，調節pH，加入飽和硫酸銨溶液，靜置；

(3)鹽析：過濾，濾液中加入飽和硫酸銨溶液，靜置；

(4)洗鎂：將上清液棄去，抽濾，并在濾餅上加入飽和硫酸鎂溶液，靜置1分鐘，抽濾，待濾液開始流出，將漏斗上剩余的硫酸鎂溶液傾去，濾餅待活化；

(5)活化：將濾餅溶于鹽酸溶液，加入氯化鈣溶液及硼酸緩沖液，再加水，調節pH，最后加入結晶胰蛋白酶進行活化，將溶液靜置；

(6)除鈣：將活化后的溶液調節pH，加入固體硫酸銨，攪拌溶解，靜置，過濾，濾液加入固體硫酸銨，靜置，過濾，得濾餅；

(7)結晶：濾餅中加入硼酸緩沖液，調節pH，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，浸于外透液中；

(8)透析：過濾得結晶物，加水溶解，調節pH；將溶液透析，去除雜質；

(9)凍干：取出透析液，抽濾，得濾液，調節pH，凍干后得結晶胰蛋白酶成品。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(1)中，胰蛋白酶粗品用水溶解，粗品與水的重量比為1∶2-1∶4，調節pH至3.0±0.5，攪拌10～16小時；每升溶液加入400～500g固體硫酸銨，待其溶解后，靜置沉淀10～16小時。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(2)中，稱取濾餅重量，加水的重量為濾餅重量的2～4倍，攪拌溶解后，調節pH至3.0±0.4，加入濾餅重量1～3倍的飽和硫酸銨溶液，靜置10～16小時。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(3)中，量濾液體積，加入等體積的飽和硫酸銨溶液，靜置10～16小時。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(5)中，稱濾餅重量，加0.001～0.01mol/L鹽酸溶液將濾餅溶解，加入0.5～2mol/L氯化鈣溶液，以及pH7.5～8.5的硼酸緩沖液，再加入水，調節pH7.0～8.0，最后每克濾餅加5～15mg的結晶胰蛋白酶進行活化處理，pH值控制在7.0～8.0；所述鹽酸溶液的加入量為濾餅重量的3～5倍，所述氯化鈣溶液的加入量為濾餅重量的1～3倍，所述硼酸緩沖液的加入量為濾餅重量的4～6倍。

7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(6)中，活化后的溶液調節pH至3.0±0.4，再按200～300g/L加入固體硫酸銨，攪拌溶解，在0～10℃中存放32～60小時使硫酸鈣沉淀，過濾，濾液中按150～250g/L加入固體硫酸銨，0～10℃時放置10～14小時，過濾，得濾餅。

8.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(7)中，按每克濾餅加入1～2mlpH8.0～10.0硼酸緩沖液，調節pH至8.0±0.4，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，浸于外透液中，溫度控制在0～10℃。

9.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(8)中，按每克結晶物加入1～3ml水溶解，調節pH至3.0±0.5，溫度控制在0～10℃，透析2～4天。

10.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(9)中，調節pH至6.0±0.4。