[發明專利]一種固料培養裂殖壺菌液體發酵生產DHA的方法

有效

• 申請號: 201210593090.0
• 申請日: 2012-12-31
• 公開（公告）號: CN103146584A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 陳金卿;陳芳芳;陳俊煌;林超;吳美瓊
• 申請（專利權）人: 廈門金達威集團股份有限公司;內蒙古金達威藥業有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P7/64;C12R1/645
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發明涉及發酵生產DHA的方法，特別涉及一種固料培養裂殖壺菌液體發酵生產DHA的方法。

背景技術

二十二碳六烯酸(Docosahexenoic?acid，22:6△4,7,10,13,16,19，簡稱DHA)俗稱“腦黃金”，屬于ω-3型多不飽和脂肪酸，具有補腦健腦，預防老年性癡呆癥；提高視力，防治近視；預防高血壓、動脈硬化、關節炎及治療癌癥等生理功能。因此，DHA作為新一代功能性保健因子具有廣闊的市場前景。隨著市場需求量的擴大，對DHA品質的要求也越來越高，DHA生產研究逐漸向利用生物技術合成方向發展，傳統魚油來源的DHA已逐漸被藻油DHA所取代。藻油DHA是指通過微生物發酵獲得的含有DHA等長鏈多不飽和脂肪酸的油脂，其中DHA生產菌主要有裂殖壺菌、破囊壺菌、隱甲藻等。

裂殖壺菌又稱裂壺藻，屬于真菌門、卵菌綱、水霉目、破囊壺菌科的一類類藻的海洋真菌，單細胞、球形。細胞累積大量對人體有用的活性物質，如油脂、色素（類胡蘿卜素、葉黃素、蝦青素）、角鯊烯等，其中總脂肪酸中DHA含量高達35%～45%，且細胞中90%以上的油脂以人體易吸收的中性油脂——甘油三酯形式存在，是DHA的理想生產菌株。

中國專利CN101575584公開一種裂殖弧菌及利用其生產DHA油脂的方法，該方法提供一種從滲透壓和元素供應角度優化菌株發酵培養基，并結合流加策略，實現裂殖壺菌高密度發酵，采用傳統的發酵方法，從甘油保存種接入搖瓶活化→一級種子液→搖瓶二級種子液→一級種子罐→二級種子罐→發酵，最終細胞干重達到70g/L，油脂含量達31.5g/L，DHA占總脂肪酸含量高于35%。

中國專利CN101519676公開一種采用含微量元素的發酵培養基進行發酵生產DHA的發酵生產工藝，采用傳統方法培養菌種裂殖壺菌，即斜面活化培養、然后轉接入搖瓶擴大培養、再經一級擴大培養得到發酵用種子液；或菌種經斜面活化培養、然后轉接入搖瓶擴大培養、再經一級擴大培養和二級擴大培養后得到發酵用種子液，10T罐發酵95h生物量為53g/L，油脂含量72%，DHA含量50%。而傳統的種子培養和發酵方法涉及的發酵級數較多，工藝較繁瑣，培養周期長，投資成本高。因此，改進種子制備方式，簡化擴種工藝，降低生產成本，有利于DHA的工業化生產。

發明內容

本發明的目的在于提供可簡化擴種工藝，縮短種子培養和發酵周期，減少投資，節約成本，固料培養基營養豐富，富含多種生長因子，更利于種子的生長，菌種細胞的生長活力強、同步性較好，培養固料種子階段產生的廢水、廢渣少，環境污染小的一種固料培養裂殖壺菌液體發酵生產DHA的方法。

本發明采用的菌種為裂殖壺菌（Schizochytrium?sp.）KDW-12，已于2012年11月20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCCNo.6843，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編為100101。

本發明包括如下步驟：

1）菌種活化與菌懸液制備：將裂殖壺菌菌種接種于斜面培養基上培養活化，培養到期斜面加入質量百分數為0.85%的生理鹽水洗滌菌體，獲得菌懸液；

在步驟1）中，所述斜面培養基的配方可為：葡萄糖20～30g/L，蛋白胨10～15g/L，酵母粉3～5g/L，海水晶15～20g/L，瓊脂粉20g/L，pH值6～7，121℃滅菌30min；所述培養活化的溫度可為25～28℃，培養活化的時間可為2～3天；所述菌懸液的菌體濃度可為1.0～2.5×10⁶個/mL。

2）一級種子制備：將步驟1）獲得的菌懸液按質量分數為1%的接種量接種至固料培養基上培養，制成一級固料種子；或

將步驟1）獲得的菌懸液按質量分數為1%的接種量接種至液體種子培養基，搖瓶培養，制成一級液體種子；

在步驟2）中，所述固料培養基包括固態組分和液體營養液組分，所述固態組分為谷物，含量為250～400g/L，所述谷物可選自米類、麥類和玉米等中的至少一種，所述米類可選自大米、小米、糙米等中的至少一種，所述麥類可選自大麥、小麥、燕麥等中的至少一種；