[發(fā)明專利]一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210593090.0
• 申請日: 2012-12-31
• 公開（公告）號: CN103146584A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設計）人: 陳金卿;陳芳芳;陳俊煌;林超;吳美瓊
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門金達威集團股份有限公司;內(nèi)蒙古金達威藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P7/64;C12R1/645
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

1.一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法，其特征在于包括如下步驟：

1）菌種活化與菌懸液制備：將裂殖壺菌（Schizochytrium?sp.）KDW-12菌種接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)活化，培養(yǎng)到期斜面加入質(zhì)量百分數(shù)為0.85%的生理鹽水洗滌菌體，獲得菌懸液；所述裂殖壺菌（Schizochytrium?sp.）KDW-12，已于2012年11月20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC?No.6843；

2）一級種子制備：將步驟1）獲得的菌懸液按質(zhì)量分數(shù)為1%的接種量接種至固料培養(yǎng)基上培養(yǎng)，制成一級固料種子；或

將步驟1）獲得的菌懸液按質(zhì)量分數(shù)為1%的接種量接種至液體種子培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)，制成一級液體種子；

3）二級固料種子的制備：一級固料種子以質(zhì)量百分數(shù)為0.85%的生理鹽水根據(jù)1:1(W/V)比例洗滌菌體，制成菌懸液；

在無菌條件下：

按質(zhì)量分數(shù)為10%～20%的接種量在固料培養(yǎng)基中接入一級固料種子液；或

按質(zhì)量分數(shù)為8%～15%的接種量在固料培養(yǎng)基中接入一級液體種子，搖動K瓶混合均勻，25～28℃，培養(yǎng)2～3天；

制得二級固料種子；

4）二級固料種子發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)：二級固料種子加入1:3～5（W/V）無菌水振蕩洗下菌體，按質(zhì)量分數(shù)為10%～20%的接種量接種至發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)，發(fā)酵前48h溫度控制在25～28℃，利用攪拌轉(zhuǎn)速保持30%～50%的溶氧，48h至發(fā)酵結(jié)束溫度控制在18～22℃，發(fā)酵3～5天，通過重量百分比為28%的氨水控制發(fā)酵pH6.0～6.5，整個發(fā)酵過程自動流加經(jīng)118℃滅菌25min的濃度為580g/L的葡萄糖溶液控制發(fā)酵葡萄糖濃度在4～8g/L；

5）發(fā)酵結(jié)束后，收集菌體細胞，提取DHA油脂。

2.如權(quán)利要求1所述的一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法，其特征在于在步驟1）中，所述斜面培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖20～30g/L，蛋白胨10～15g/L，酵母粉3～5g/L，海水晶15～20g/L，瓊脂粉20g/L，pH值6～7，121℃滅菌30min；所述培養(yǎng)活化的溫度可為25～28℃，培養(yǎng)活化的時間可為2～3天；所述菌懸液的菌體濃度可為1.0～2.5×10⁶個/mL。

3.如權(quán)利要求1所述的一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法，其特征在于在步驟2）中，所述固料培養(yǎng)基包括固態(tài)組分和液體營養(yǎng)液組分，所述固態(tài)組分為谷物，含量為250～400g/L，所述谷物可選自米類、麥類和玉米中的至少一種，所述米類可選自大米、小米、糙米等中的至少一種，所述麥類可選自大麥、小麥、燕麥中的至少一種。

4.如權(quán)利要求1所述的一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法，其特征在于在步驟2）中，所述液體營養(yǎng)液組分包括組分1和組分2，所述組分1的組成為：葡萄糖2～5g/L，七水硫酸鎂0.2～0.6g/L，磷酸氫二鉀1.0～5.0g/L，海鹽0.1～0.8g/L，甘氨酸0.2～0.6g/L，蘇氨酸1.5～1.8g/L，蛋氨酸2～3.5g/L，蘋果酸3～6g/L，加水定容，調(diào)節(jié)pH值為6～7；所述組分2的組成為：La³⁺10～15mg/L，Ce³⁺1～4mg/L，Sm³⁺2～6mg/L，Nd³⁺8～12mg/L，Mn²⁺0.6～1.2mg/L，Co²⁺0.05～0.1mg/L，生物素0.2～0.6mg/L，淺藍菌素0.1～0.3mg/L，赤霉素GA2～5mg/L，VB₁₂0.5～1.0mg/L，葉酸0.01～0.05mg/L，余量為水。

5.如權(quán)利要求1所述的一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法，其特征在于在步驟2）中，所述固料培養(yǎng)基的制備方法為：固態(tài)組分與液體營養(yǎng)液組分1混合均勻，將谷物蒸或煮至谷物中心無白心，且含水率為50%～65%，獲得固料培養(yǎng)基原料；將固料培養(yǎng)基原料與液體營養(yǎng)液組分2混合均勻，裝于固態(tài)發(fā)酵K瓶中，厚度0.2～1.0cm，121℃滅菌30min，制得固料培養(yǎng)基。