[發明專利]莖瘤芥抗逆基因及其植物表達載體和構建方法及應用

有效

• 申請號: 201210592295.7
• 申請日: 2012-12-29
• 公開（公告）號: CN103014035A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 向瀏欣;蔡應繁;付于銀;劉吉軍;冉燕子;王秋娟;王小艷
• 申請（專利權）人: 重慶郵電大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/12;C12N15/84;C12N15/66;A01H5/00
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及莖瘤芥抗逆基因BjPERK1及其植物表達載體和構建方法及應用。

背景技術

高鹽、干旱和低溫等非生物脅迫對作物的產量及生長發育有很大影響，因此，有關植物抗逆性的研究一直是植物學研究領域的熱點之一。

莖瘤芥（Brassica?juncea?var.tumida?Tsen?et?Lee），又稱青菜頭，是十字花科蕓薹屬植物，為榨菜的主要原料，是我國重慶、四川、浙江等地區主要的經濟作物之一。多年來，莖瘤芥的相關研究主要集中在遺傳育種、良種繁育、栽培技術、品質安全等領域，近年才陸續有生物學方面研究的報道，包括基因的克隆、功能研究以及莖瘤芥瘤狀莖膨大相關研究，企圖通過基因工程方法提高莖瘤芥的產量、質量以及抗病性、抗逆性等。

近年來對植物受體蛋白激酶（receptor?protein?kinase，PERK）類基因的研究表明，它們可能參與了植物細胞抗逆反應、植物形態發生、自交不親和等生理生化反應。而本實驗室（重慶郵電大學分子生物學實驗室）對莖瘤芥永安小葉品種的瘤莖膨大前后的轉錄組測序獲得了序列SEQ?ID?NO.3，該序列有303bp，經NCBI的blastx比對，預測為受體蛋白激酶蛋白基因（本發明將其命名為BjPERK1）片段，而BjPERK1基因的功能是什么，是否可以增強植物抗逆性，于是本發明將通過RACE擴增獲得全長序列和植物表達載體構建與遺傳轉化，希望獲得該基因的具體功能以便能夠通過對莖瘤芥的基因工程改造獲得更好的品種。

對于莖瘤芥受體蛋白激酶基因BjPERK1，目前還未見其全基因序列以及基因功能的報道，而本發明經實驗驗證，該基因蛋白具有提高植物抗逆性的作用，促進了植物在逆境條件下的適應能力和生長能力。

發明內容

鑒于此，本發明的目的之一是提供莖瘤芥抗逆基因BjPERK1，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1所示，該基因全長2252bp，通過NCBI的ORF工具檢測知其最大開放閱讀框1923bp，5’端非編碼區有99bp，3’端非編碼區有230bp。

本發明的目的之二是提供莖瘤芥抗逆基因蛋白BjPERK1，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO.2所示，有640個氨基酸，且序列通過NCBI的保守結構域（conserved?domains）檢測知具有蛋白激酶催化結構域。

本發明的目的之三是提供莖瘤芥抗逆基因BjPERK1的重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERK1，其由抗逆基因BjPERK1的最大開放閱讀框序列（編碼序列）與植物表達載體pCAMBIA1302構成。

本發明的目的之四是提供莖瘤芥抗逆基因BjPERK1的重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERK1的構建方法，包括如下步驟：

（1）莖瘤芥抗逆基因BjPERK1的克隆

A.BjPERK1基因5’端未知序列擴增

根據序列SEQ?ID?NO.3設計兩個反向巢式引物：

BjPERK1-AOUT：5'-AGTCCTTTAGCAGATCCAAGAGCA-3'

BjPERK1-AIN：5'-AATCTGGTGCTCCATTCCATTGTA-3'；

提取莖瘤芥莖的總RNA，然后通過5’-Full?RACE?Kit試劑盒方法獲得cDNA第一鏈并進行巢式PCR擴增，產物連接到pMD19-T載體，轉化DH5α感受態細胞，篩選并測序獲得5’端序列；

B．BjPERK1基因3’端未知序列擴增

根據序列SEQ?ID?NO.3設計兩個正向巢式引物：

BjPERK1-SOUT：5'-TGCTTGTCTATGAGTTTGTTCCTA-3'

BjPERK1-SIN：5'-GCAATCCTAAAATCATTCACCGTG-3'

提取莖瘤芥莖的總RNA，然后用接頭引物5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30MN-3'（N=A,G,C或T;M=A,G或C；d(T)30代表30個連續的T堿基）以及M-MLV反轉錄酶反轉獲得cDNA第一鏈并進行巢式PCR擴增，產物連接到pMD19-T載體，轉化DH5α感受態細胞，篩選并測序獲得3’端序列；

C．BjPERK1基因全長序列擴增

將所述獲得的5’端序列、3’端序列與序列SEQ?ID?NO.3拼接，并從5’端非翻譯區和3’端非翻譯區設計一對引物：