[發明專利]莖瘤芥抗逆基因及其植物表達載體和構建方法及應用

有效

• 申請號: 201210592295.7
• 申請日: 2012-12-29
• 公開（公告）號: CN103014035A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 向瀏欣;蔡應繁;付于銀;劉吉軍;冉燕子;王秋娟;王小艷
• 申請（專利權）人: 重慶郵電大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/12;C12N15/84;C12N15/66;A01H5/00
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

1.莖瘤芥抗逆基因BjPERK1，其特征在于：其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1所示，全長序列2252bp，最大開放閱讀框1923bp，5’端非編碼區有99bp，3’端非編碼區有230bp。

2.莖瘤芥抗逆基因蛋白BjPERK1，其特征在于：其氨基酸序列為SEQ?ID?NO.2所示。

3.莖瘤芥抗逆基因BjPERK1的重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERK1，其特征在于：由權利要求1所述的抗逆基因BjPERK1的最大開放閱讀框序列與植物表達載體pCAMBIA1302構成。

4.權利要求3所述的莖瘤芥抗逆基因BjPERK1的重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERK1的構建方法，其特征在于：包括如下步驟：

（1）莖瘤芥抗逆基因BjPERK1的克隆

A.BjPERK1基因5’端未知序列擴增

根據序列SEQ?ID?NO.3設計兩個反向巢式引物：

BjPERK1-AOUT：5'-AGTCCTTTAGCAGATCCAAGAGCA-3'

BjPERK1-AIN：5'-AATCTGGTGCTCCATTCCATTGTA-3'；

提取莖瘤芥莖的總RNA，然后通過5’-Full?RACE?Kit試劑盒方法獲得cDNA第一鏈并進行巢式PCR擴增，產物連接到pMD19-T載體，轉化DH5α感受態細胞，篩選并測序獲得5’端序列；

B．BjPERK1基因3’端未知序列擴增

根據序列SEQ?ID?NO.3設計兩個正向巢式引物：

BjPERK1-SOUT：5'-TGCTTGTCTATGAGTTTGTTCCTA-3'

BjPERK1-SIN：5'-GCAATCCTAAAATCATTCACCGTG-3'

提取莖瘤芥莖的總RNA，然后用接頭引物和反轉錄酶反轉獲得cDNA第一鏈并進行巢式PCR擴增，產物連接到pMD19-T載體，轉化DH5α感受態細胞，篩選并測序獲得3’端序列；

C．BjPERK1基因全長序列擴增

將所述獲得的5’端序列、3’端序列與序列SEQ?ID?NO.3拼接，并從5’端非翻譯區和3’端非翻譯區設計一對引物：

上游引物BjPERK1-F：5'-CGTGTCTCCTCTCTCCTCCTGCTT-3'

下游引物BjPERK1-R：5'-AACCTTCAATTTCTCTCCCATCTG-3'；

再以步驟B中的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，產物連接到pMD19-T載體，轉化DH5α感受態細胞，篩選并測序獲得BjPERK1基因全長序列；

（2）植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERK1的構建

根據BjPERK1基因的最大開放閱讀框序列設計一對引物，并分別引入酶切位點Bgl?II和BstE?II序列：

上游引物BjPERK1-Bgl：5’-AGATCTATGTCCTCGGCGCCGTCT-3’；

下游引物BjPERK1-Bst：5’-GGTAACCTTACAAAAAAGGGCCACTAT-3’；

再以步驟（1）B中的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，產物連接到pMD19-T載體得重組質粒pMD19-T-BjPERK1，轉化DH5α感受態細胞；提取質粒pMD19-T-BjPERK1和pCAMBIA1302，并用Bgl?II和BstE?II雙酶切后連接，轉化，篩選并測序驗證，植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERK1構建成功。

5.如權利要求4所述的莖瘤芥抗逆基因BjPERK1的重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjPERK1的構建方法，其特征在于，所述接頭引物的序列為5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30MN-3′，其中N=A,G,C或T，M=A,G或C；所述反轉錄酶為M-MLV酶。

6.莖瘤芥抗逆基因BjPERK1在提高植物耐鹽特性的應用。