[發(fā)明專利]一種重組甘露聚糖酶及其基因工程菌和水解制備甘露寡糖的方法

有效

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• 申請日: 2012-12-29
• 公開（公告）號: CN103146724A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設計）人: 馬立新;趙西選;喻詩;李曄星;王亞平;姚永蘭
• 申請（專利權）人: 湖北大學;湖北花果山實業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N1/19;C12N15/81;C12N9/42;C12P19/14;C12R1/84
• 代理公司: 武漢金堂專利事務所 42212
• 代理人: 丁齊旭

技術領域

本發(fā)明涉及一種編碼重組的β-甘露聚糖酶的畢赤酵母基因工程菌株的構建以及利用畢赤酵母表達甘露聚糖酶的方法，同時，利用該重組甘露聚糖酶水解高濃度甘露聚糖制備甘露寡糖的方法，在工業(yè)生產中無需調節(jié)PH，操作簡單，能夠降低生產成本，縮短工藝流程，簡化后續(xù)處理步驟。?

背景技術

甘露低聚糖是由2一10個單糖分子通過糖苷鍵連接而成的低度聚合糖，可以有效促進生物體內以雙歧桿菌為代表的腸道有益菌群的特異性增殖，并具有抑制體內病原菌生長、減少有毒代謝產物產生、防止便秘、保護肝臟、抗腫癌及增強機體免疫力等多種生理功能。此外，低聚甘露糖還具有不被人體降解、低甜度、不引發(fā)齲齒、不增加血糖濃度等特點，是新一代功能性食品。?

近年來，關于低聚糖的研究越來越多，已有多種功能性低聚糖產品投入市場，但目前大多數(shù)低聚糖產品屬于普通型的低聚糖，有效成分不足50％。歐美等國因限于資源，主要采用化學合成方法和從酵母細胞壁分離提取甘露低聚糖，其中酵母發(fā)酵法成本低，污染少，但它們的產品純度低、性能差。為了提高產品純度，必須在后續(xù)工藝中使用操作復雜成本過高的提純工序，例如離子交換色譜法、凝膠過濾色譜法等。酵母發(fā)酵法生產的關鍵是甘露聚糖酶。如何尋找高活力的甘露聚糖酶，使水解的效率提高，使產品的純度提高，使后續(xù)提純工序簡單有效，能低成本地生產高純度低聚糖，顯得尤為重要。?

甘露聚糖酶，是一類能夠水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及半乳葡萄甘露聚糖的內切酶，能水解植物膠(如角豆膠、瓜兒豆膠和魔芋等)生成低聚甘露糖。甘聚聚糖酶廣泛存在于自然界中，在動物、植物和微生物體內有該酶的存在，而微生物是其主要來源。芽孢桿菌、假單胞菌、弧菌、真菌中的曲霉、青霉、酵母菌和放線菌中的鏈霉菌都是產甘露聚糖酶的常見菌群。國內現(xiàn)在有許多相關科研單位，如中科院微生物研究所，南開大學等廣泛進行了甘露聚糖酶及其相關內容的研究，但所報道的發(fā)酵酶活性不高，酶解產物純度低，生產成本高，難以工業(yè)化。?

魔芋是我國南方地區(qū)的特有經(jīng)濟作物，其主要成分為葡甘聚糖，在西南貧困山區(qū)產量很高，目前在國內主要作為一種粗纖維食糧或作為食品添加劑，附加值不高。將魔芋利用甘露聚糖酶經(jīng)酶法水解制成甘露低聚糖，有很好的市場前景。在生產中的一般甘露聚糖酶活性差，水解效率低，底物濃度低，不能適應生產的要求。?

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是運用基因工程手段尋找畢赤酵母偏愛密碼，構建重組的β-甘露聚糖酶基因，實現(xiàn)甘露聚糖酶的高效穩(wěn)定表達，同時利用表達的重組β-甘露聚糖酶水解高濃度甘露聚糖制備甘露寡糖。?

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的。本發(fā)明的步驟為：?

一、重組β-甘露聚糖酶基因的合成?

在氨基酸序列不改變的前提下，對原始的β-甘露聚糖酶基因的核苷酸序列利用DNAWORKS工具進行優(yōu)化，優(yōu)化后的基因全部由畢赤酵母偏愛密碼組成。優(yōu)化后的核苷酸序列與原始基因的核苷酸序列(GeneBank^TM?accession?XM_001390670.1)相比，有257個核苷酸發(fā)生變化，核苷酸的同源性為76％。同時為了使β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中能夠高效穩(wěn)定的分泌表達，優(yōu)化后的β-甘露聚糖酶基因少了編碼5’端信號肽序列的20個氨基酸。?

優(yōu)化前的序列：?

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