[發明專利]一種以蘄蛇為原料提取Ⅱ型膠原蛋白的方法

無效

• 申請號: 201210591584.5
• 申請日: 2012-12-30
• 公開（公告）號: CN103088096A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 丁興紅;谷恒存;丁志山;蔣福升;范永升
• 申請（專利權）人: 浙江中醫藥大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/34
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

（一）技術領域

本發明涉及一種以蘄蛇為原料提取Ⅱ型膠原蛋白的方法。?

（二）背景技術

Ⅱ型膠原（collagen?typeⅡ，CⅡ）是軟骨基質的主要有機成分，是關節軟骨中主要細胞外間質之一。近年來研究表明，類風濕性關節炎的發病與CⅡ自身免疫反應有關[Deyl?Z,?Miksik?I,?Eckhardt?A.?Preparative?procedures?and?purity?assessment?of?collagen?proteins?[J].Chromatography?B,?2003,79(12):?245-275.?Smolen?JS,?Hayer?S,?Schett?G,?et?al.?Immunosenescence?autoimmunity?and?Rheumatoid?Arthritis?[J].?Autoimmunity?and?rheumatoid?arthritis,?2004,?31(1):?23-25.]，用CⅡ免疫某些動物可誘導出實驗性關節炎[Sweeney?SE,?Firestein?GS.?Rheumatoid?arthritis:?regulation?of?synovial?inflammation?[J].?Intern?J?Biochemical?Cell?Bio,?2004,?36(3):?372-378.]，口服CⅡ誘導免疫耐受對類風濕性關節炎(Rheumatoid?Arthritis，RA)有顯著的療效[盧延旭,陳敏珠.可溶性雞Ⅱ型膠原對關節炎大鼠的免疫治療作用[J].中國臨床藥理學與治療學，2004，9?(2):?180-183.]。因此，CⅡ的提取純化與鑒定的研究具有較大的價值，獲得純化的CⅡ是進行相關研究的關鍵。雖然CⅡ在人體含量較多，但臨床取材可獲得的數量有限；CⅡ與蛋白多糖形成緊密的結合，難以用單純的化學方法提取。目前所報道的方法，操作復雜，條件不一，結果存在差別。?

（三）發明內容

本發明目的是提供一種以蘄蛇為原料提取Ⅱ型膠原蛋白的方法。?

本發明采用的技術方案是：?

一種以蘄蛇為原料提取Ⅱ型膠原蛋白的方法，所述方法包括：?

（1）蘄蛇粉末用鹽酸胍-Tris-HCl混合溶液混懸，4~6℃攪拌24~30h，離心，去上清，沉淀用40~60?mM?Tris-HCl溶液洗滌除去鹽酸胍；所述鹽酸胍-Tris-HCl混合溶液中鹽酸胍濃度為4~5M，Tris-HCl濃度為40~60?mM；?

（2）步驟（1）所得沉淀用0.5~1?M乙酸水溶液重懸，以60~80%甲酸水溶液調節pH值為2~3，加入足量胃蛋白酶，4~6℃攪拌48~60h，離心，棄去沉淀；?

（3）步驟（2）得到上清液滴加5~6M?NaCl溶液至NaCl濃度為0.8~0.9?M，4~6℃靜置12~24h，離心，去除上清液；?

（4）步驟（3）得到沉淀用足量0.05~0.2?M乙酸溶解，轉入截留分子量50000道爾頓的透析袋中、用20~30?mM?Na₂HPO₄充分透析，所得沉淀再用足量0.05~0.2M乙酸溶解，轉入截留分子量10000道爾頓的透析袋中、用0.05~0.2M乙酸溶液充分透析，所得液體真空干燥，得到所述Ⅱ型膠原蛋白的粉末。?

蘄蛇為蝰科動物五步蛇?Agkistrodon?acutus（Güenther）的干燥體。【性味】甘、咸，溫；有毒。【歸經】歸肝經。【功能主治】祛風，通絡，止痙。用于風濕頑痹，麻木拘攣，中風口眼歪斜，半身不遂，抽搐痙攣，破傷風，麻風疥癬。臨床發現，蘄蛇是臨床治療風濕痹證的要藥，對RA有明顯的治療作用[國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版一部[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:349.]，實驗研究表明蘄蛇及Ⅱ型膠原蛋白對RA都具有一定的治療作用[Kyung-Su?Park,?Min-Jung??Park,?Mi-La?Cho,?et?al.?Type?Ⅱ?collagen?oral?tolerance;?mechanism?and?role?in?collagen-induced?arthritis?and?rheumatoid?arthritis[J].?Modern?Rheumatology,?2009,6(19):581-589.]。本發明選擇蘄蛇為原料，用鹽酸胍去除蛋白多糖、胃蛋白酶消化、氯化鈉鹽析和透析處理等步驟，制備出高純度（純度96.93%）的Ⅱ型膠原蛋白，采用SDS-PAGE、紫外全波長掃描、HPLC和質譜對其進行了純度分析和鑒定。?