[發明專利]一種以蘄蛇為原料提取Ⅱ型膠原蛋白的方法

無效

• 申請號: 201210591584.5
• 申請日: 2012-12-30
• 公開（公告）號: CN103088096A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 丁興紅;谷恒存;丁志山;蔣福升;范永升
• 申請（專利權）人: 浙江中醫藥大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/34
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

1.一種以蘄蛇為原料提取Ⅱ型膠原蛋白的方法，所述方法包括：

（1）蘄蛇粉末用鹽酸胍-Tris-HCl混合溶液混懸，4~6℃攪拌24~30h，離心，去上清，沉淀用40~60?mM?Tris-HCl溶液洗滌除去鹽酸胍；所述鹽酸胍-Tris-HCl混合溶液中鹽酸胍濃度為4~5M，Tris-HCl濃度為40~60?mM；

（2）步驟（1）所得沉淀用0.5~1?M乙酸水溶液重懸，以60~80%甲酸水溶液調節pH值為2~3，加入足量胃蛋白酶，4~6℃攪拌48~60h，離心，棄去沉淀；

（3）步驟（2）得到上清液滴加5~6M?NaCl溶液至NaCl濃度為0.8~0.9?M，4~6℃靜置12~24h，離心，去除上清液；

（4）步驟（3）得到沉淀用足量0.05~0.2?M乙酸溶解，轉入截留分子量50000道爾頓的透析袋中、用20~30?mM?Na₂HPO₄充分透析，所得沉淀再用足量0.05~0.2M乙酸溶解，轉入截留分子量10000道爾頓的透析袋中、用0.05~0.2M乙酸溶液充分透析，所得液體真空干燥，得到所述Ⅱ型膠原蛋白的粉末。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述蘄蛇粉末粒徑不大于2mm。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2）中胃蛋白酶加入量為300~800?U/g?蘄蛇粉末。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1）中所述蘄蛇粉末與鹽酸胍-Tris-HCl混合溶液用量之比為100g：1000~5000mL。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2）中步驟（1）所得沉淀與乙酸水溶液用量之比為100g：1000~3000mL。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：

（1）蘄蛇粉碎至粒徑為2mm，粉末用鹽酸胍-Tris-HCl混合溶液混懸，4℃攪拌24h，4℃、14000×g離心1h，去上清，沉淀用50?mM?Tris-HCl溶液洗滌除去鹽酸胍；所述鹽酸胍-Tris-HCl混合溶液中鹽酸胍濃度為4M，Tris-HCl濃度為50?mM，pH7.5；

（2）步驟（1）所得沉淀用0.5?M乙酸水溶液重懸，以70%甲酸水溶液調節pH值為2.8，加入胃蛋白酶，4℃攪拌48h，4℃、14000×g離心1h，棄去沉淀；所述胃蛋白酶加入量為300~800?U/g蘄蛇粉末；

（3）步驟（2）得到上清液滴加5M?NaCl溶液至NaCl濃度為0.8~0.9?M，46℃靜置12h，4℃、14000×g離心1h，去除上清液；

（4）步驟（3）得到沉淀用0.1?M乙酸溶解，轉入截留分子量50000道爾頓的透析袋中、用20?mM?Na₂HPO₄于4℃下充分透析，所得沉淀再用0.1M乙酸溶解，轉入截留分子量10000道爾頓的透析袋中、用0.1M乙酸溶液于4℃下充分透析，所得液體真空干燥，得到所述Ⅱ型膠原蛋白的粉末。