[發明專利]微型高效萊克多巴胺免疫親和純化富集柱制備及應用

有效

• 申請號: 201210589314.0
• 申請日: 2012-12-31
• 公開（公告）號: CN103100237A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 謝體三;李軍;寧歡歡;潘麗金;葉云峰;韋良云;蕭浩
• 申請（專利權）人: 南寧市藍光生物技術有限公司;廣西壯族自治區獸藥監察所
• 主分類號: B01D15/22
• 分類號: B01D15/22;G01N1/34
• 代理公司: 廣西南寧明智專利商標代理有限責任公司 45106
• 代理人: 黎明天

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技術領域

本發明涉及一種生物分離、純化富集裝置，尤其是一種微型高效萊克多巴胺免疫親和層析柱的制備方法及其應用。

背景技術

萊克多巴胺均屬于β-興奮劑，可以提高瘦肉率、促進動物生長。因其經濟效益明顯，利益驅使養殖戶或養殖企業大量使用，導致畜產品中萊克多巴胺大量殘留，人食用這類畜產品后，可引發肌肉震顫、心悸、神經過敏、頭痛、目眩、惡心等中毒癥狀，特別是對血壓、心臟病患者危害更大，長期使用可能導致染色體畸變，誘發惡性腫瘤。萊克多巴胺在許多國家，特別是歐盟和中國，被禁止用做家畜促生長劑。所以，對動物來源的食品中萊克多巴胺殘留進行嚴格地檢測是非常重要。

由于生物樣本成分復雜，待測物濃度低，大多數取樣量少，而我國明確規定禁止萊克多巴胺及其衍生物在動物的飼養過程中使用。這就對分析方法的靈敏度、準確度有更高的要求。采用免疫親和色譜柱提取樣品中萊克多巴胺，再與高效液相色譜法（HPLC-UV）、氣-質聯機法（GC-UV）、膠體金快速試紙條檢測法確證是必然的趨勢。但是，現有的提取萊克多巴胺免疫親和色譜柱的技術與工藝存在活化后填料不穩定、非親和法提純的抗體特異性差、抗體和填料偶聯不穩定，造成偶聯在填料上的抗體脫落、裝柱體積偏大（裝柱體積1毫升以上），提取萊克多巴胺時造成洗脫體積大、富集效率低，減低了確證的準確度和靈敏度。

發明內容

本發明的目的是提供一種高效、準確純化富集萊克多巴胺的免疫親和純化富集柱及其制備方法和用途。

本發明釆取的技術方案：

本發明的目的是提供一種高效、特異性分離純化、富集萊克多巴胺（Sal）的免疫親和純化富集柱制備方法及其應用。

為達上述目的，本發明2次采用抗原抗體的特異性反應和可離解的特性Ag?+?Ab?(固相)??ó?Ag-Ab?（固相）原理，具體如下：

首先利用這一原理將萊克多巴胺乙酰酯偶聯到活化瓊脂糖（Agarose）上制得Sal?-?Agarose親和柱，用于提取萊克多巴胺特異性多克隆抗體。

再利用這一原理將提取所得的抗萊克多巴胺特異性抗體（Anti-Sal）偶聯到Agarose上制得Anti-Sal-?Agarose免疫親和柱，用于分離純化、富集待檢樣品中的萊克多巴胺。

根據上述機理，本發明采用如下具體技術步驟：

一種萊克多巴胺免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于：????

1）將經免疫親和純化的萊克多巴胺特異性多克隆抗體和過碘酸活化的瓊脂糖混勻，在搖床上室溫反應30?分鐘，然后在4℃冰箱靜置30分鐘后加入硼氫化鈉還原，用蒸餾水清洗未結合的抗體，用磷酸緩沖液清洗填料，10倍填料體積/次，洗4次，滴干磷酸緩沖液后加入等體積甘油，混勻，得到萊克多巴胺免疫親和填料；?

2）在特制的塑料柱內下端裝上過濾膜，將萊克多巴胺免疫親和填料裝入柱中，25μL/柱，填料上層蓋上過濾膜，即得所述的萊克多巴胺免疫親和純化富集柱。

所述的萊克多巴胺免疫親和純化富集柱，包括偶聯有免疫親和純化的萊克多巴胺特異性多克隆抗體的瓊脂糖填料及裝載該填料的特制塑料柱。

所述的免疫親和純化的萊克多巴胺特異性多克隆抗體是用萊克多巴胺與溴乙酰氯反應得到衍生物萊克多巴胺溴乙酰酯溶液，用反向高效液相色譜HPLC純化該溶液，得到純化后的萊克多巴胺溴乙酰酯，將純化后的萊克多巴胺溴乙酰酯與載體蛋白偶聯，得到該偶聯物作為免疫原免疫動物，得到抗血清，同時用該純化后的萊克多巴胺溴乙酰酯與經活化的瓊脂糖珠反應制備純化抗體用的免疫親和柱，用該親和柱一步提取抗血清得到萊克多巴胺特異性多克隆抗體。

所述的萊克多巴胺溴乙酰酯制備方法是將萊克多巴胺標準品在三乙胺催化下與溴乙酰氯反應得到衍生物萊克多巴胺溴乙酰酯溶液。將此萊克多巴胺溴乙酰氯酯溶液用制備型高效液相色譜儀反向柱色譜分離純化出相對于萊克多巴胺標準品峰后移，且具有萊克多巴胺紫外光吸收光譜特征的單一主峰組分，收集該主峰組分得到純化的萊克多巴胺溴乙酰酯。

所述的萊克多巴胺溴乙酰酯與載體蛋白偶聯制備免疫原，是用十二烷基硫酸鈉SDS變性牛血清蛋白BSA或卵清蛋白OVA等常用載體蛋白，再與碘乙酸-羥基琥珀酰亞胺酯即NHS-碘乙酸反應，再用二硫蘇糖醇DTT還原，得到巰基化的BSA或OVA?；通過葡聚糖凝膠G25?Sephadex脫鹽去掉多余的二硫蘇糖醇后，將萊克多巴胺溴乙酰酯與巰基化的BSA或OVA混合，調pH=8.5，在室溫搖動反應60分鐘，經G25?Sephadex脫鹽后得到的為免疫原。