[發(fā)明專利]一種尿液中肌酐的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210588726.2
• 申請(qǐng)日: 2012-12-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102980968A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯宏衛(wèi);張小濤;田永峰;劉彤;陳歡;韓書(shū)磊;胡清源
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心
• 主分類號(hào): G01N30/88
• 分類號(hào): G01N30/88
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

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技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于尿液樣本的理化檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種尿液中肌酐的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

連續(xù)完全采集志愿者實(shí)驗(yàn)期間的24小時(shí)尿液能夠提供更準(zhǔn)確毒物接觸劑量水平。尿液樣本的完整性是實(shí)驗(yàn)組織者首先需要關(guān)心的問(wèn)題，一般采用肌酐的24小時(shí)清除率來(lái)確定樣本的完整性，或者用肌酐比率來(lái)校正尿液濃度。近年來(lái)，肌酐作為校正因子廣泛應(yīng)用于煙氣相關(guān)生物標(biāo)志物的濃度校正，包括可替寧、NNAL和巰基尿酸等。

尿液中肌酐的檢測(cè)方法主要有Jaffe法、酶解分光光度法、HPLC法、毛細(xì)管電泳法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法、GC-MS法和LC-MS/MS法。LC–MS/MS由于其高靈敏度與選擇性，被廣泛應(yīng)用于尿液和血液等生物基質(zhì)中肌酐的檢測(cè)。Hoskova發(fā)展了一種快速分析肌酐的電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜法，尿液樣本通過(guò)固相萃取后直接進(jìn)入串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。此方法雖然省去了尿液樣本的分離時(shí)間，但是尿液基質(zhì)只通過(guò)固相萃取后就直接進(jìn)入質(zhì)譜分析可能會(huì)污染儀器，串聯(lián)質(zhì)譜的選擇分離遠(yuǎn)不如液相色譜柱。Park報(bào)道了一種LC-MS-MS直接分析尿肌酐的方法，尿液只需甲醇稀釋與過(guò)濾后就可以進(jìn)樣檢測(cè)。但是，肌酐在反相C18柱上的保留時(shí)間是0.59?min，難以與尿液中水溶性的干擾物分開(kāi)。本發(fā)明旨在建立一種簡(jiǎn)單、快速、選擇性好的LC-MS-MS方法測(cè)定尿液中的肌酐。?

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的旨在克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種采用LC-MS/MS測(cè)定卷煙尿液中肌酐含量的方法，該方法能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)尿液中肌酐的含量，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、測(cè)定干擾少。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：?

一種尿液中肌酐的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法，包括以下工藝步驟：

a、收集志愿者尿液；

b、樣品前處理：室溫下解凍尿液樣品，混合均勻后，取1?mL的尿液并加入10?μL的甲酸酸化到pH=2.5左右，在10000?轉(zhuǎn)/min的條件下離心10?min，離心的混合物過(guò)0.22?μm聚醚砜水相濾膜，取5?μL濾液于10?mL棕色容量瓶，加入100?μL濃度為1?μg/mL的肌酐-d3，用純水定容至刻度；

c、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：用純水配制不同濃度的肌酐標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

d、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測(cè)定，吸取配制好的不同濃度的肌酐標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，肌酐的線性回歸方程為y=0.0106x+0.00615，其中Y代表分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，X表示尿液中目標(biāo)分析物的濃度。相關(guān)系數(shù)大于0.999，對(duì)樣品待測(cè)液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測(cè)液中分析物的含量。

步驟b中的稀釋過(guò)程依次加入的肌酐-d3和離心過(guò)濾后的尿液的體積分別為100?μL和5?μL。?

在步驟d中，所述的色譜分析條件為色譜柱采用Agilent?Zorbax?Eclipse?XDB-C18色譜柱（150?mm×2.1?mm，3.5?μm），初始流動(dòng)相體系選取50%?溶劑A（0.1%?乙酸水溶液）和50%?溶劑B（0.1%?乙酸甲醇溶液），分析時(shí)間為12?min，進(jìn)樣量為5?μL。?

采用色譜柱分析時(shí)，選取的洗脫條件：50%的0.1%?乙酸水溶液和50%的0.1%?乙酸甲醇溶液等度洗脫，流動(dòng)相流速為200?μL/min。?

串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器的條件：電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子掃描方式；電噴霧電壓為5000V,?霧化氣為40?psi,?氣簾氣的量為30?psi,?輔助加熱氣的流速為40?psi,?離子源溫度為480?oC，射入電壓：10?V,?碰撞能：29?eV；?去簇電壓：73?V，駐留時(shí)間：100?ms。?

本發(fā)明具體的工藝過(guò)程進(jìn)一步詳述如下：?

1?尿液收集

收集志愿者尿液。

2?樣品前處理?

b、樣品前處理：室溫下解凍尿液樣品，混合均勻后，取1?mL的尿液并加入10?μL的甲酸酸化到pH=2.5左右，在10000?轉(zhuǎn)/min的條件下離心10?min。離心的混合物過(guò)0.22?μm聚醚砜水相濾膜。取5?μL濾液于10?mL棕色容量瓶，加入100?μL肌酐-d3（1?μg/mL），用純水定容至刻度，取5?μL濾液引入LC-MS/MS分離分析。

3?LC-MS/MS測(cè)定?

（1）LC-MS/MS條件