[發(fā)明專利]一種柱轉(zhuǎn)換測(cè)定尿液中CEMA和HEMA含量的方法

無(wú)效

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• 申請(qǐng)日: 2012-12-29
• 公開（公告）號(hào): CN103063776A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯宏衛(wèi);張小濤;田永峰;劉彤;陳歡;韓書磊;胡清源
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

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技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于尿液樣本的理化檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及尿液樣本的巰基尿酸測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種采用液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定尿液中N-乙酰基-S-（2-腈基乙基）-L-半胱氨酸（CEMA）和N-乙酰基-S-（2-羥基乙基）-L-半胱氨酸（HEMA）含量的方法。

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背景技術(shù)：

丙烯腈是含有活性乙烯基和腈基的a,b-不飽和腈類化合物。它可以通過(guò)代謝活化后形成活性更強(qiáng)的環(huán)氧型中間體，進(jìn)一步與體內(nèi)的細(xì)胞大分子的親核中心共價(jià)結(jié)合，從而造成機(jī)體的損傷。體外毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，丙烯腈具有一定的致癌性。1999年，IARC將其歸為可能的人類致癌物。丙烯腈存在于卷煙煙氣中（7.8-39.1?μg/支煙），普通人群可以通過(guò)吸入卷煙煙氣接觸丙烯腈，從而增加健康風(fēng)險(xiǎn)。丙烯腈進(jìn)入體內(nèi)后于可以直接或通過(guò)代謝活化后于GSH，形成兩種巰基尿酸代謝物：CEMA和HEMA。尿液中的CEMA和HEMA不僅能提供丙烯腈及其可能的代謝中間物及其與GSH結(jié)合機(jī)制的有關(guān)信息，而且能在一定程度上反映丙烯腈在體內(nèi)的代謝狀況。2007年，Scherer等研究了CEMA和HEMA等生物標(biāo)志物與抽吸卷煙原型物釋放量之間的關(guān)系，用于評(píng)估接觸風(fēng)險(xiǎn)。

柱轉(zhuǎn)換LC-MS/MS方法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種在線前處理并檢測(cè)尿液中代謝物的方法。較早就有研究者將其應(yīng)用于檢測(cè)尿液中低含量的羥基多環(huán)芳烴（OH-PAH）類化合物，此方法采用的一個(gè)修飾的多孔硅膠填充柱在線前處理尿液樣本，純化后的分析物用HPLC檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了低含量的羥基多環(huán)芳烴的在線檢測(cè)。但是定制色譜柱的價(jià)格昂貴，并且此方法還需要一個(gè)液固萃取過(guò)程來(lái)凈化尿液樣本，不能實(shí)現(xiàn)完全的在線分析。

Simon等改進(jìn)了上述的柱轉(zhuǎn)換方法，使用一套柱轉(zhuǎn)換-HPLC檢測(cè)了尿液中的3-羥基苯并[a]芘，此系統(tǒng)包含四個(gè)六通閥和三個(gè)預(yù)處理小柱，來(lái)回切換來(lái)實(shí)現(xiàn)樣品的在線凈化與富集。此方法雖然實(shí)現(xiàn)了尿液樣本的在線純化與富集，但是系統(tǒng)過(guò)程復(fù)雜，較多的前處理小柱處理樣本會(huì)降低方法的回收率。2008年，Schettgen將柱轉(zhuǎn)換方法與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，應(yīng)用于檢測(cè)尿液中的苯巰基尿酸。此方法選取了一種較為新穎的限進(jìn)色譜填料小柱，由于此小柱兼具體積排阻色譜和反相色譜的功能，能夠較好的除去尿液基質(zhì)的大分子物質(zhì)和水溶性鹽類，從而降低基質(zhì)效應(yīng)，提高靈敏度。2009年，Schettgen應(yīng)用此方法同時(shí)檢測(cè)尿液中的CEMA和1,3-丁二烯的兩種巰基尿酸代謝物。此方法雖然能夠在線的檢測(cè)尿液中的CEMA，但是方法的定量限為1?ng/mL，不能滿足普通人群尿液中CEMA含量的檢測(cè)（<1?ng/mL）,并且此柱轉(zhuǎn)換方法需要添加一個(gè)獨(dú)立的單元泵，用于進(jìn)樣和純化樣品流動(dòng)相，而此單元泵不但價(jià)格昂貴，且不能由質(zhì)譜軟件同步控制。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的旨在克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種采用柱轉(zhuǎn)換LC-MS/MS測(cè)定尿液中CEMA和HEMA含量的方法，該方法能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)尿液中CEMA和HEMA的含量，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、測(cè)定干擾少。

本發(fā)明建立了一種改進(jìn)的柱轉(zhuǎn)換-LC-MS/MS方法測(cè)定尿液中的CEMA和HEMA，該方法無(wú)需額外的獨(dú)立單元泵，整個(gè)儀器系統(tǒng)和分析過(guò)程由Analyst操作軟件同步控制。方法靈敏度高，可以有效的除去大分子蛋白，降低基質(zhì)干擾。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：尿液中CEMA和HEMA含量的測(cè)定方法，包括以下工藝步驟：

a、收集志愿者尿液。

b、樣品前處理：尿液在室溫下解凍，混合均勻。準(zhǔn)確移取0.5?mL的尿液，加入20?μL的甲酸和10?μL混合內(nèi)標(biāo)，加入470?μL的50?mM的甲酸銨水溶液（甲酸調(diào)節(jié)到pH=2.5），混勻后在10000?rpm的條件下離心5?min。取上清液過(guò)0.22?μm的聚醚砜水相濾膜，進(jìn)LC-MS/MS分析。

c、利用甲醇配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；

d、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測(cè)定，吸取配制好的不同濃度的CEMA和HEMA標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，CEMA的線性回歸方程為y?=0.0372x?+0.0489,?HEMA的線性回歸方程為y?=?0.0291x?+?0.0144，其中Y代表分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，X表示尿液中目標(biāo)分析物的濃度。相關(guān)系數(shù)大于0.999，對(duì)樣品待測(cè)液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測(cè)液中分析物的含量。

在本發(fā)明中，所述混合內(nèi)標(biāo)為氘代內(nèi)標(biāo)，氘代內(nèi)標(biāo)濃度為1?μg/mL。