[發明專利]重組人IFN-β-1a及其生產和純化方法

有效

• 申請號: 201210587363.0
• 申請日: 2012-12-28
• 公開（公告）號: CN103898123B
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發明（設計）人: 宋楠萌;涂祁鵬;杜伯雨;張磊;薛劍峰;劉家望;趙娟;金孟燮
• 申請（專利權）人: 北京韓美藥品有限公司
• 主分類號: C12N15/22
• 分類號: C12N15/22;C12N15/63;C12N5/10;C12P21/02;C07K1/22;C07K1/18;C07K1/16;C12R1/91
• 代理公司: 隆天知識產權代理有限公司 72003
• 代理人: 王芝艷;吳小瑛

1.核酸，其編碼人IFN-β-1a且其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.表達質粒，其中包含權利要求1所述的核酸。

3.如權利要求2所述的表達質粒，其選自由以下組成的組：pcMV、pEGFP、pcDNA、pUB6、pVAX和X0GC。

4.用權利要求2或3所述的表達質粒轉染的哺乳動物細胞系。

5.如權利要求4所述的細胞系，其中，所述細胞系選自3T3細胞、COS細胞、人骨肉瘤細胞、MRC-5細胞、BHK細胞、VERO細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、HEK 293細胞、常人纖維母細胞、肝細胞和PER.C6細胞中的一種。

6.如權利要求4所述的細胞系，其中，所述細胞系為中國倉鼠卵巢細胞(CHO)。

7.如權利要求4所述的細胞系，其中，所述細胞系為CHO/DG44細胞系。

8.如權利要求4所述的細胞系，其中，所述細胞系為基質細胞。

9.如權利要求4所述的細胞系，其中，所述細胞系為CHO-S細胞。

10.一種構建表達重組人IFN-β-1a的穩定哺乳動物細胞系的方法，所述方法包括：

使用G418硫酸鹽進行篩選并選擇甲氨蝶呤(MTX)加壓擴增系統，其中MTX的濃度為10～1000nM；

其中，所述重組人IFN-β-1a由權利要求1所述的核酸編碼。

11.如權利要求10所述的方法，其中，MTX的濃度為10～20nM。

12.如權利要求10所述的方法，其中，MTX的濃度為10nM、15nM或20nM。

13.如權利要求10所述的方法，其中使用X0GC作為表達質粒，使用CHO/DG44細胞系作為宿主細胞系。

14.大規模生產重組人IFN-β-1a的方法，其中所述方法使用表達重組人IFN-β-1a的穩定哺乳動物細胞系，且所述方法包括：

使用具有雙層濾網的過濾器的生物反應器，通過雙層濾網截留細胞，收獲發酵液，其中所述濾網的孔徑為5μm-10μm，且將細胞培養液的pH在7.1至7.4之間，

其中所述重組人IFN-β-1a由權利要求1所述的核酸編碼。

15.如權利要求14所述的方法，其中，所述濾網的孔徑為5μm、8μm或10μm。

16.如權利要求14所述的方法，其中，所述濾網是孔徑為5μm和10μm組成的雙層濾網。

17.如權利要求14所述的方法，其中，所述方法還包括：

在大規模生產前將表達重組人IFN-β-1a的穩定哺乳動物細胞系進行無血清懸浮適應培養，并使最初的貼壁細胞適應無血清懸浮生長。

18.如權利要求17所述的方法，其中所述懸浮適應培養可以通過直接加入無血清培養液或者逐步降低血清的方法而進行。

19.如權利要求14至18中任一項所述的方法，其中在大規模生產重組人IFN-β-1a的過程中使用的培養液為無血清培養液。

20.如權利要求14至18中任一項所述的方法，其中，所述方法還包括：

采用灌注培養的方式，每天灌注體積為1～10倍罐體積；

生產的過程包括兩個階段，第一階段為生長期，在37℃溫度下進行，第二階段為生產期，溫度低于37℃。