[發明專利]一種氨基脲(SEM)衍生化試劑及其使用方法

有效

• 申請號: 201210586467.X
• 申請日: 2012-12-31
• 公開（公告）號: CN103105488A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 戴信敏
• 申請（專利權）人: 戴信敏
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 寧濤;張廣育

技術領域

本發明屬于免疫化學檢測領域，涉及一種氨基脲衍生化試劑及其在氨基脲的衍生化的方法，以及其衍生物的夾心ELISA檢測方法。

背景技術

呋喃西林(nitrofurazone)屬于硝基呋喃類藥物，是一種廣譜抗菌藥物，被廣泛作治療藥物和飼料添加劑用于禽、畜、水產養殖中控制疾病或疫情。呋喃西林在臨床上表現為明顯的三致作用(致癌、致畸、致突變)，因此引起各國的高度重視，歐盟早在1995年就禁止呋喃西林用作獸藥，澳大利亞、美國也相繼在2001年和2002年出臺了相關法律，將呋喃西林作為養殖禁用藥物。

呋喃西林在動物體內極易降解，短短數小時內即可代謝為呋喃西林代謝物氨基脲(式一)，氨基脲易與蛋白質結合，該結合產物性質較穩定不易分解，可在動物體內存留數周。因此氨基脲常被用作檢測呋喃西林原藥的標記物，世界上大多數國家都以監測氨基脲來達到對呋喃西林原藥監控的目的。

式一氨基脲分子結構

目前對檢測呋喃西林殘留物氨基脲的方法主要采用液液萃取-高效液相色譜(HPLC)法、固相萃取-高效液相色譜法，高效液相色譜-串聯質譜(LC-MS-MS)法等。這些方法主要存在需要大型儀器，一般實驗室不能滿足，檢測時間長，衍生物萃取純化過程復雜，檢測通量低不能滿足現場檢測和大樣本檢測等缺點，已不能滿足目前檢測的需求。

近幾年也建立了一些氨基脲的酶聯免疫檢測技術，但普遍存在衍生物萃取、純化效率低以及萃取試劑對抗體的負面影響等問題，這些對于檢測的穩定性和精度造成較大影響。而且由于氨基脲是小分子，目前只能采用競爭法進行檢測。該方法需要半抗原的合成，由于不同批次的半抗原存在一定的差別，不同批次的產品存在一定差異，因此檢測穩定性受到影響。因此，本領域迫切需要開發一種簡便、穩定的氨基脲夾心檢測方法。

發明內容

針對上述問題，發明人發明了一種氨基脲衍生化試劑以及基于該試劑的試劑盒。本發明的氨基脲衍生化試劑能簡化氨基脲衍生物的分離和純化步驟，免去了氨基脲半抗原的制備和使用，并可實現其夾心ELISA法的檢測，從而極大地簡化了檢測步驟、降低檢測時間和操作誤差，同時增強檢測的穩定性、精密度和靈敏度。

本發明的第一個目的在于提供一種氨基脲衍生化試劑。

該衍生化試劑是帶有特異性小分子標記的醛基苯酸衍生物，該分子能通過醛基與氨基脲的氨基反應，形成氨基脲的衍生物。所述的醛基苯酸衍生物包括對醛基苯酸衍生物和鄰醛基苯酸衍生物。所述的特異性小分子標記包括生物素(biotin)、地高辛(digoxin)、組氨酸、熒光分子(CY-5，CY-3，FITC，FAM等)。所述的小分子通過一段短臂連接在醛基苯酸的羧基上，所述短臂為任選地摻雜N或O或S或P的2-30個C的直鏈分子，所述的小分子優選生物素。以生物素修飾為例，其化學結構式如式2。

式2生物素標記的衍生化試劑的分子結構

本發明的第二個目的在于建立一種使用上述衍生化試劑檢測氨基脲的夾心ELISA方法。

本發明所述的抗體是采用氨基脲與醛基苯甲酸衍生化后的產物與BSA、KLH、OVA等偶聯后的半抗原制備的鼠單抗、兔多抗及相應的針對該衍生物表位的基因工程抗體，所述抗體優選鼠單抗。

本發明所述的衍生化在低PH條件下(PH值為1-5)進行，衍生產物不經過萃取或其他純化等過程，直接加入或用雜交液稀釋后加入到酶標板中，所述PH值優選2。

本專利所述的二抗是辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶標記的能與所述特異性小分子結合的蛋白或抗體及其偶聯物，例如親和素/鏈霉親和素、地高辛抗體、組氨酸抗體/含Ni親和分子、熒光分子抗體等。

在本發明所述的夾心ELISA法中，板上包被的抗體通過SEM-醛基苯甲酸分子固定小分子-二抗-HRP復合物(如生物素-鏈霉親和素-HRP復合物)，從而實現夾心法對氨基脲的檢測。根據氨基脲衍生物的含量即可推算出樣品中氨基脲含量。

通過該方法能有效檢測樣品中的氨基脲，該方法靈敏度為0.07ng/mL，樣本添加回收率達95％以上。

本發明的第三個目的在于提供基于本發明的氨基脲衍生化試劑，用于氨基脲的夾心ELISA檢測的試劑盒。