[發明專利]一種器官型人工皮膚、其制備方法及應用

有效

• 申請號: 201210585481.8
• 申請日: 2012-12-28
• 公開（公告）號: CN103893831A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 黃亞東;張齊好;項琪;蘇志堅;戴桃李
• 申請（專利權）人: 廣州暨南大學醫藥生物技術研究開發中心
• 主分類號: A61L27/60
• 分類號: A61L27/60;A61L27/22;A61F2/10
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 紀曉峰

技術領域

本發明屬于人工器官組織工程技術領域，具體地涉及一種新型器官型人工皮膚及其構建方法。

背景技術

近年來，構建具有表皮和真皮雙層結構的器官型人工皮膚一直是研究的重點。體外構建的人工皮膚要求結構與功能與正常皮膚相似，否則只是一層細胞，無法滿足實際的研究和應用需要。如美國Advanced?TissueSciences公司開發的SKIN2?^TM皮膚，是將成纖維細胞種植于尼龍網中形成真皮組織，再將角質形成細胞種植于真皮上形成表皮部分。但是現有的人工皮膚模型大多數只有角質形成和成纖維兩種細胞，引入皮膚其它細胞的模型研究還不多見，由于細胞種類有限，難以發揮多種細胞間的協同作用，并不能完全用于復制皮膚的正常功能；另一方面，由于角質形成細胞是瞬間放大細胞，自我更新能力有限，易退出細胞周期進入終末分化。這是阻礙器官型人工皮膚進入實際應用的主要瓶頸問題之一。

人工皮膚走過了單層細胞培養、人工表皮立體培養和器官型人工皮膚構建的發展過程。早期開發的所謂人工皮膚僅是單層培養的細胞膜片，后來，濾孔嵌套技術得到應用，人們將表皮細胞移植于膠原凝膠、纖維素海綿等支架上三維培養，構建復層表皮，如商品化的Episkin、EpiDerm和SkinEthic產品。2003年歐萊雅公司的科學家將KC、MC、LC細胞共培養構建新型表皮，使表皮的組成更接近正常皮膚。但它們都屬于表皮的組織型培養，還不是真正意義上的器官型人工皮膚。

因此，本領域中存在著對其組成接近于哺乳動物正常皮膚結構的器官型人工皮膚的需求，其在需要皮膚替代物、臨時覆蓋物和仿皮膚模型等的臨床應用、毒理學分析、藥理學研究和分析中具有重大的應用意義并提供重要的治療手段和研究工具。

發明內容

本發明的目的是提供一種能夠解決現有技術中的上述問題的新型器官型人工皮膚。本發明通過將成纖維細胞種植在脫細胞的羊膜上構建好真皮層，上面覆蓋一層基質材料，再將角質形成細胞接種于基質材料上；其次，本發明還將羊水干細胞與重組人膠原蛋白復合成膜后再分別種植成纖維細胞和角質形成細胞，通過氣液交界培養形成角質化上皮結構，得到兼具真皮層和表皮層結構的器官型人工皮膚。

因此，在第一個方面，本發明提供了一種器官型人工皮膚(下面有時簡稱“本發明的人工皮膚”)，其由包括以下成分的生物材料構建而成：成纖維細胞、脫細胞羊膜、基質材料及角質形成細胞。

本發明的器官型人工皮膚還可以由包括以下成分的生物材料構建而成：成纖維細胞、羊水干細胞、基質材料及角質形成細胞。

在本發明的器官型人工皮膚中，主要由成纖維細胞和脫細胞羊膜構成類似于哺乳動物皮膚真皮層的仿真皮層結構，所述角質形成細胞形成類似于哺乳動物皮膚表皮層的仿表皮層結構，所述基質材料形成類似于哺乳動物皮膚基底層的仿基底層結構，由此獲得與哺乳動物正常皮膚解剖結構非常相似的人工皮膚。

在本發明的器官型人工皮膚的一個優選實施方案中，成纖維細胞為分離自下述細胞的體外培養物：哺乳動物皮膚的成纖維細胞，優選人源成纖維細胞，包括分離的原代幼兒皮膚成纖維細胞、成人皮膚成纖維細胞和幼兒包皮成纖維細胞，最優選幼兒包皮成纖維細胞的體外培養物。

在本發明的器官型人工皮膚的另一個優選實施方案中，基質材料為親水性高分子材料，所述親水性高分子材料優選地由天然的或合成的細胞外基質蛋白形成。細胞外基質蛋白優選地選自纖維連接蛋白、層粘連蛋白、I型膠原蛋白、III型膠原蛋白、IV型膠原蛋白、玻璃粘連蛋白或其組合，更優選是合成的細胞外基質蛋白，最優選人重組III型膠原蛋白或人重組IV型膠原蛋白。

在本發明的器官型人工皮膚的另一個優選實施方案中，羊水干細胞分離自哺乳動物孕期羊水，優選哺乳動物孕中期的羊水，經體外培養而得。在本發明中，羊水干細胞在體外培養的代數不受限制，只要其表達干細胞特定基因(例如，ssea-4、oct-4，如通過免疫組化測定)即可。優選使用體外培養3～10代的羊水干細胞，這樣可以保留羊水干細胞較大的定向誘導和分化能力。

在第二個方面，本發明提供了一種器官型人工皮膚的制備方法，該方法包括以下步驟：

1)將體外培養的成纖維細胞按照1×10⁵～5×10⁵個細胞/cm³的密度種植在分離自哺乳動物胎盤的脫細胞羊膜上加入培養基培養2～4天構建成仿真皮層；

2)在所述仿真皮層上面覆蓋一層厚度約1mm的基質材料；