[發明專利]一種抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉胺酶活性的多肽及其篩選方法和應用

有效

• 申請號: 201210585268.7
• 申請日: 2012-12-28
• 公開（公告）號: CN103060283A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 路福平;劉逸寒;藺松;王春霞;王建玲
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/70;G01N21/64;C12R1/54;C12R1/55;C12R1/585;C12R1/465
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 王來佳

1.氨基酸序列為SEQ?ID?No:1的多肽在抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉胺酶活性中的應用。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于：應用的方法步驟如下：

將所述多肽和凝血因子Xa可識別酶切位點序列連接，形成polypeptide-I-E-G-R，枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉胺酶基因再定向克隆到polypeptide-I-E-G-R的下游，形成polypeptide-I-E-G-R-BTG片段；該多肽以融合蛋白的形式抑制BTG的活性，經凝血因子Xa酶切后去除此多肽，恢復枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉胺酶活性。

3.抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉胺酶活性的多肽，其特征在于：所述多肽為將SEQ?ID?No:1的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉胺酶活性的多肽。

4.一種篩選抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉胺酶活性多肽的方法，其特征在于：步驟如下：

⑴選擇來源不同的鏈霉菌的谷氨酰胺轉胺酶前肽序列；

⑵通過重疊延伸PCR將來源不同的鏈霉菌谷氨酰胺轉胺酶前肽克隆到枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉胺酶的N端，兩者之間添加凝血因子Xa識別序列連接；?

⑶將全部編碼序列克隆入pET-28a(+)的NdeI與HindIII酶切識別位點之間；

⑷在E.Coli?BL21（DE3）菌株中重組表達，親和層析純化得到HIS融合的編碼序列的融合蛋白；

⑸通過熒光法檢測融合蛋白的酶活，篩選對枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉胺酶活性抑制率最高的前肽序列，即得抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉胺酶活性的多肽。?

5.根據權利要求4所述的篩選抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉胺酶活性多肽的方法，其特征在于：所述步驟⑴中來源不同的鏈霉菌為S.cinnamoneus、S.caniferus、S.fradiae、S.hygroscopicus、S.mobaraense、S.netropsis和S.platensis。

6.根據權利要求4所述的篩選抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉胺酶活性多肽的方法，其特征在于：所述步驟⑸中熒光法檢測的具體步驟如下：?

將純化濃縮后的蛋白液各取500μL，平分成兩份，其中的一份用凝血因子?Xa酶切6h，獲得去除了N端多肽序列的成熟枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉胺酶，測得各蛋白液的熒光強度，計算得出酶活，通過比較未經凝血因子?Xa酶切的酶活相對于切割后的酶活，得到各多肽序列對枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉胺酶活性的抑制率。

7.根據權利要求6所述篩選抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉胺酶活性多肽的方法，其特征在于：所述熒光強度的檢測步驟為：

反應體系的總體積1mL：N,N-二甲基酪蛋白0.67g/L，丹磺尸胺(MDC)8.33μmol/L，Tris·HCl?pH7.5?50?mmol/L，DTT?3mmol/L，酶液200μL；反應體系于37℃反應30min，加入10mmol/L(NH₄)₂SO₄終止反應，于激發波長350nm和發射波長500nm下檢測熒光強度。