[發(fā)明專(zhuān)利]一種抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽及其篩選方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210585268.7
• 申請(qǐng)日: 2012-12-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103060283A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 路福平;劉逸寒;藺松;王春霞;王建玲
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/10;C12N15/70;G01N21/64;C12R1/54;C12R1/55;C12R1/585;C12R1/465
• 代理公司: 天津盛理知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 王來(lái)佳

1.氨基酸序列為SEQ?ID?No:1的多肽在抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性中的應(yīng)用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：應(yīng)用的方法步驟如下：

將所述多肽和凝血因子X(jué)a可識(shí)別酶切位點(diǎn)序列連接，形成polypeptide-I-E-G-R，枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因再定向克隆到polypeptide-I-E-G-R的下游，形成polypeptide-I-E-G-R-BTG片段；該多肽以融合蛋白的形式抑制BTG的活性，經(jīng)凝血因子X(jué)a酶切后去除此多肽，恢復(fù)枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性。

3.抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽，其特征在于：所述多肽為將SEQ?ID?No:1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽。

4.一種篩選抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性多肽的方法，其特征在于：步驟如下：

⑴選擇來(lái)源不同的鏈霉菌的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶前肽序列；

⑵通過(guò)重疊延伸PCR將來(lái)源不同的鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶前肽克隆到枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的N端，兩者之間添加凝血因子X(jué)a識(shí)別序列連接；?

⑶將全部編碼序列克隆入pET-28a(+)的NdeI與HindIII酶切識(shí)別位點(diǎn)之間；

⑷在E.Coli?BL21（DE3）菌株中重組表達(dá)，親和層析純化得到HIS融合的編碼序列的融合蛋白；

⑸通過(guò)熒光法檢測(cè)融合蛋白的酶活，篩選對(duì)枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性抑制率最高的前肽序列，即得抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽。?

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性多肽的方法，其特征在于：所述步驟⑴中來(lái)源不同的鏈霉菌為S.cinnamoneus、S.caniferus、S.fradiae、S.hygroscopicus、S.mobaraense、S.netropsis和S.platensis。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性多肽的方法，其特征在于：所述步驟⑸中熒光法檢測(cè)的具體步驟如下：?

將純化濃縮后的蛋白液各取500μL，平分成兩份，其中的一份用凝血因子?Xa酶切6h，獲得去除了N端多肽序列的成熟枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，測(cè)得各蛋白液的熒光強(qiáng)度，計(jì)算得出酶活，通過(guò)比較未經(jīng)凝血因子?Xa酶切的酶活相對(duì)于切割后的酶活，得到各多肽序列對(duì)枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的抑制率。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述篩選抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性多肽的方法，其特征在于：所述熒光強(qiáng)度的檢測(cè)步驟為：

反應(yīng)體系的總體積1mL：N,N-二甲基酪蛋白0.67g/L，丹磺尸胺(MDC)8.33μmol/L，Tris·HCl?pH7.5?50?mmol/L，DTT?3mmol/L，酶液200μL；反應(yīng)體系于37℃反應(yīng)30min，加入10mmol/L(NH₄)₂SO₄終止反應(yīng)，于激發(fā)波長(zhǎng)350nm和發(fā)射波長(zhǎng)500nm下檢測(cè)熒光強(qiáng)度。