[發(fā)明專利]一種抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽及其篩選方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210585268.7
• 申請日: 2012-12-28
• 公開（公告）號: CN103060283A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設計）人: 路福平;劉逸寒;藺松;王春霞;王建玲
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/70;G01N21/64;C12R1/54;C12R1/55;C12R1/585;C12R1/465
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 王來佳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶簡稱BTG)活性的多肽及其篩選方法和應用。

背景技術(shù)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(transglutaminase，EC2.3.2.13，簡稱TG)，是一種催化酰基轉(zhuǎn)移反應的酶，能催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間以及蛋白質(zhì)與氨基酸之間形成ε-(γ-Glu)-Lys異肽鍵使其共價交聯(lián)聚合，從而直接改變蛋白質(zhì)本身以及蛋白質(zhì)所附著的細胞、組織等的結(jié)構(gòu)與功能，因而該酶在食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)中具有廣泛的應用。TG的生產(chǎn)方法有動植物組織提取法和微生物發(fā)酵法兩種。TG的早期生產(chǎn)采用動物組織提取法，但由于動物組織來源少、提取工藝復雜、回收率低、產(chǎn)品成本過于昂貴的緣故，酶的生產(chǎn)應用一直受到很大限制。微生物來源的TG因其酶活性不依賴Ca²⁺，且最有希望實現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)，引起了廣泛關(guān)注，目前僅茂源鏈霉菌來源的TG實現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)應用在食品加工中。鏈霉菌屬來源的TG具有信號肽和前肽，由于前肽的作用，使得鏈霉菌來源的TG在細胞內(nèi)沒有活性，而不損害細胞，然后通過信號肽分泌到細胞外，實現(xiàn)TG的生產(chǎn)。

和鏈霉菌來源的TG相比，枯草芽孢桿菌來源的TG研究要少得多，1996年才由Kobayashi等首次在枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了TG，其沒有信號肽和前肽，只存在于芽孢上，交聯(lián)芽孢表面蛋白，防止其被蛋白酶降解，從而起到保護芽孢的作用。由于TG具有蛋白交聯(lián)的活性，對宿主細胞具有毒性作用，因此，雖然2007年葡萄牙Placido等實現(xiàn)BTG在大腸桿菌中表達，但是在不同的誘導和培養(yǎng)條件下酶得率都非常低。目前，仍難以大量制備枯草芽孢桿菌來源的BTG。

通過檢索，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明專利申請相關(guān)的專利公開文獻：

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽及其篩選方法和應用，該多肽使BTG能夠在宿主細胞低活性表達，減輕BTG對宿主細胞的毒性作用，而經(jīng)過蛋白酶簡單處理后其活性又能得到恢復，為BTG的高效表達奠定了基礎。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

氨基酸序列為SEQ?ID?No:1的多肽在抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性中的應用。

而且，應用的方法步驟如下：

將所述多肽和凝血因子Xa可識別酶切位點序列連接，形成polypeptide-I-E-G-R，枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因再定向克隆到polypeptide-I-E-G-R的下游，形成polypeptide-I-E-G-R-BTG片段；該多肽以融合蛋白的形式抑制BTG的活性，經(jīng)凝血因子Xa酶切后去除此多肽，恢復枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性。

抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽，所述多肽為將SEQ?ID?No:1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽。

一種篩選抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性多肽的方法，步驟如下：

(1)選擇來源不同的鏈霉菌的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶前肽序列；

(2)通過重疊延伸PCR將來源不同的鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶前肽克隆到枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的N端，兩者之間添加凝血因子Xa識別序列連接；

(3)將全部編碼序列克隆入pET-28a(+)的NdeI與HindIII酶切識別位點之間；

(4)在E.Coli?BL21(DE3)菌株中重組表達，親和層析純化得到HIS融合的編碼序列的融合蛋白；

(5)通過熒光法檢測融合蛋白的酶活，篩選對枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性抑制率最高的前肽序列，即得抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽。

而且，所述步驟(1)中來源不同的鏈霉菌為S.cinnamoneus、S.caniferus、S.fradiae、S.hygroscopicus、S.mobaraense、S.netropsis和S.platensis。

而且，所述步驟(5)中熒光法檢測的具體步驟如下：

將純化濃縮后的蛋白液各取500μL，平分成兩份，其中的一份用凝血因子Xa酶切6h，獲得去除了N端多肽序列的成熟枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，測得各蛋白液的熒光強度，計算得出酶活，通過比較未經(jīng)凝血因子Xa酶切的酶活相對于切割后的酶活，得到各多肽序列對枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的抑制率。

而且，所述熒光強度的檢測步驟為：