[發明專利]含Fc融合蛋白的酵母表達載體及其構建方法

無效

• 申請號: 201210584662.9
• 申請日: 2012-12-28
• 公開（公告）號: CN103898154A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 萬曉春;呂衛東;王蒲;向軍儉
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/66
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 吳平

技術領域

本發明涉及一種酵母表達載體及其構建方法，特別涉及一種含Fc融合蛋白的酵母表達載體及其構建方法。

背景技術

抗體的Fc端負責抗體的效應功能，如激活補體、結合Fc受體、穿越胎盤等。Fc融合蛋白主要是將生物活性蛋白與IgG的絞鏈區及CH2、CH3區結合。含Fc段的抗體融合蛋白將某些蛋白質與抗體Fc段融合主要是為了產生兩種效果：一是增加該蛋白質分子在血液中的半衰期；二是通過該蛋白分子與其配體的相互作用將Fc段的生物學效應引導到特定目標。

目前常用的表達載體中未含有Fc端融合蛋白的基因，在表達該類蛋白時需要自己構建，現有技術方案制備Fc融合蛋白是將生物活性蛋白的基因與Fc段基因通過重疊PCR連接好后，再構建到表達載體中，比較費時，費力。

發明內容

基于此，針對現有技術表達載體中未含有Fc端融合蛋白的基因，構建含有Fc的表達載體時，費時費力的問題，本發明提供含Fc融合蛋白的酵母表達載體及其構建方法。

解決上述技術問題的具體技術方案如下：

一種含Fc融合蛋白的酵母表達載體的構建方法，包括如下步驟：

（1）制備Fc基因片段，所述Fc基因片段的堿基組成如SEQ?ID?NO.3所示；

（2）將步驟（1）所得的Fc基因片段連接到pMD18-T載體中，得連接產物pMD18T-Fc；

（3）構建表達載體：將步驟（2）所得的連接產物pMD18T-Fc和表達載體pPICZαA經EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切，并利用T4DNA連接酶連接，得含Fc融合蛋白的酵母表達載體pPICZαA-Fc。

在其中一些實施例中，步驟（1）所述制備Fc基因片段的制備方法為：以人IgG1的重鏈恒定區為模板，用引物擴增，得Fc基因片段。

在其中一些實施例中，所述的引物為：

上游引物：GAATTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT，

下游引物：GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC。

在其中一些實施例中，步驟（2）所述的連接為：于21-23℃連接0.9-1.1h。

根據上述構建方法制得一種含Fc融合蛋白的酵母表達載體。

本發明一種含Fc融合蛋白的酵母表達載體及其構建方法具有以下優點和有益效果：

本發明的構建方法，可快速、高效地表達含Fc端的融合蛋白；利用該方法得到的含Fc端融合蛋白的酵母表達載體，是將非Ig蛋白與抗體分子的Fc段融合，即直接將具生物活性的蛋白基因構建到該表達載體，所得到的酵母表達載體，可顯著改善的非Ig蛋白藥物動力學特性，并使某些生物學活性與抗體的生物學效應功能聯結在一起。

附圖說明

圖1為人IgG1Fc基因PCR擴增結果示意圖；

圖2為所制備的載體pPICZαA-Fc構建示意圖；

圖3為pPICZαA-Fc瓊脂糖凝膠電泳圖。

具體實施例

本發明通過將IgG₁的絞鏈區及CH2、CH3區即Fc段，構建到酵母表達pPICZαA中，獲得一種含Fc融合蛋白的酵母表達載體及其構建方法，該構建方法可快速、高效的表達含Fc端的融合蛋白。

為了能夠更清楚地理解本發明的技術內容，特舉以下實施例結合附圖詳細說明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New?York:Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學試劑或者試劑盒，均為市售產品。

其中，質粒H：暨南大學鄧寧教授惠贈PMD18T-PLCH；

所用培養基的配方如下：

LB培養基：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl1g，溶于100mL去離子水中，高壓蒸氣滅菌。

含Amp的LB瓊脂平板培養基：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl1g，1.5g瓊脂條溶于100mL去離子水中，高壓蒸氣滅菌，滅菌完成后待溫度降為50℃是加入Amp，使終濃度為50μg/mL。