[發明專利]表達特異性HBV shRNA的重組HBV載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201210584159.3
• 申請日: 2012-12-30
• 公開（公告）號: CN103014045A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 李俊剛;毛青;王宇明
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/113;A61K48/00;A61P31/20
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

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技術領域

本發明涉及分子生物學領域，特別涉及表達特異性HBV?shRNA的重組HBV載體，還涉及該載體的構建方法和應用。

背景技術

乙型肝炎病毒（hepatitis?B?virus?）是引起人類急、慢性肝炎的DNA病毒，也稱丹氏顆粒，簡稱HBV。HBV屬嗜肝DNA?病毒科?(hepadnaviridae)，基因組長約3.2kb，有四個ORF，編碼以下蛋白：Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白和S蛋白（L，M，S）。Core是核衣殼蛋白；X蛋白對病毒復制是重要的，并與肝癌的發生有關；S蛋白是病毒的包膜蛋白，與病毒進入細胞有關。

HBV超螺旋共價、閉合、環狀DNA分子（covalently?closed?circularDNA，cccDNA）的持續存在是HBV慢性感染的根源，松弛環狀DNA（RC?DNA）是cccDNA形成的前體，故阻斷RC?DNA的合成將致cccDNA減少。研究發現缺失某些序列的突變型rHBV的RC?DNA合成效率更高，rHBV與HBV共存于細胞內時，由于rHBV具有如下特性：①合成效率高，rHBV將在數量上占優；②rHBV自身不能合成復制所必需的Core、Pol蛋白，需利用野生HBV的Core、Pol蛋白進行復制，從而競爭性抑制野生HBV的復制，但不能完全抑制。因此尋找一種能夠完全抑制野生HBV的方法是解決HBV持續慢性感染的關鍵。

發明內容

本發明的目的之一在于提供表達特異性HBV?shRNA的重組HBV載體，能夠依賴野生型HBV進行復制，并且形成RC?DNA，為慢性HBV感染的治療提供了新的工具。

為實現上述發明目的，技術方案為：

表達特異性HBV?shRNA的重組HBV載體，所述乙型肝炎病毒shRNA表達載體由LJ196載體刪除2111-2643位、187-680位或1060-1500位堿基后，在刪除序列處替換識別所述刪除序列的shRNA轉錄結構單元而得。

優選的，所述shRNA轉錄結構單元由啟動子和shRNA編碼序列組成。

優選的，所述啟動子為H1啟動子。

更優選的，所述shRNA編碼序列如SEQ?ID?NO.13、SEQ?ID?NO.16、SEQ?ID?NO.19、SEQ?ID?NO.22或SEQ?ID?NO.25所示。

本發明的目的之二在于提供表達特異性HBV?shRNA的重組HBV載體的制備方法，其制備方法簡單，重復性好，技術方案為：

所述重組HBV載體的制備方法，根據LJ196載體序列設計引物，然后以LJ196載體為模板，進行PCR擴增，得刪除LJ196載體2111-2643位、187-680位和1060-1500位堿基的序列，同時克隆H1啟動子并分別與所得序列連接，環化后在H1啟動子3’端連入識別所述刪除序列的shRNA的轉錄結構單元，得重組HBV載體。

優選的，所述引物為SEQ?ID?NO.2-7所示的核酸序列。

更優選的，所述克隆H1啟動子的具體方法為：以SEQ?ID?NO.8和SEQ?ID?NO.9所示核酸序列為引物，以pLVTHM質粒為模板，進行PCR擴增，得H1啟動子。

本發明的目的之三在于提供乙型肝炎病毒shRNA表達載體的應用，技術方案為：

所述重組HBV載體在制備干擾乙型肝炎病毒基因組DNA復制的藥物中的應用。

本發明有益效果在于：本發明公開的重組HBV載體，刪除病毒蛋白表達元件，并保留RC?DNA合成必須順式元件，并在刪除序列處替代shRNA轉錄結構單元（由H1啟動子和shRNA序列組成，不足300bp），用以表達靶向被刪除序列的shRNA，使其特異性降解野生型HBV?pgRNA，阻斷RC?DNA合成及cccDNA的形成；該重組HBV載體依賴野生型HBV復制并且不會整合入宿主基因組中，因此重組HBV載體只能在感染HBV病毒的細胞中存活，在正常細胞中會很快消失，不會影響正常細胞的生長，也不會引起轉基因細胞發生突變。