[發明專利]利用轉基因動物乳腺生物平臺大規模生產重組人丁酰膽堿酯酶的方法

有效

• 申請號: 201210583474.4
• 申請日: 2012-12-27
• 公開（公告）號: CN103898101B
• 公開（公告）日: 2017-08-08
• 發明（設計）人: 黃躍進
• 申請（專利權）人: 上海桀蒙生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/63;C12N5/10;C12N9/18;A61K38/46;A61P39/02;A61P11/00;A01K67/027
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司31266
• 代理人: 祝蓮君,雷芳

技術領域

本發明屬于生物制藥技術領域，具體地涉及利用轉基因動物乳腺生物平臺大規模生產重組人丁酰膽堿酯酶的方法。

背景技術

在過去的四十年中，基因工程技術的發展突飛猛進。大量基因藥品陸續問世，年產值達數十億美元。

基因工程藥物的生產方法可以分為二大類。

第一類方法是將特定的藥物基因導入到工程菌或工程細胞中，經細菌或細胞發酵培養，分離純化得到。這一方法的特點是技術簡單，但生產成本高，藥物生物學活性不高。

第二類方法是轉基因動物制藥。所謂轉基因動物制藥是將藥物蛋白基因導入到動物體內(如牛或奶山羊)，然后使藥物從乳腺或其它器官中生產出來，通過提純等工序制成基因工程藥品。此法的特點是產量高，成本低，藥物生物學活性穩定，但是技術較復雜，前期投資較高。近年來，由于基因工程技術的不斷完善和動物克隆技術的發明，轉基因動物制藥已成為研發非常活躍的領域。

與基因工程細胞反應器相比，轉基因動物制藥具有高效益、低成本、高產量、高質量、能耗低、無污染等諸多優點。

西方發達國家已有二十多年轉基因動物制藥開發歷史，技術已趨成熟。最近，美國GTC公司在羊奶中生產的(一種人體抗凝血蛋白)已獲歐洲EMEA和FDA批準，進入歐洲和美國市場。這是第一個通過轉基因在羊奶中生產的上市藥品，對轉基因工業界而言具有里程碑意義。中國雖然在此領域的科學研究已取得進展，但工業化則剛剛起步。

膽堿酯酶是一類參與神經遞質傳遞的酯酶總稱，其主要功能是在神經膽堿能突觸水解乙酰膽堿。此類突觸存在于人類、其他脊椎動物及昆蟲的神經系統。當這些突觸不斷發射信號時，肌肉、腺體和神經元會受到刺激或抑制。神經遞質乙酰膽堿的作用是傳遞這些刺激信號，而膽堿酯酶通過水解乙酰膽堿阻止其信號傳遞。膽堿酯酶抑制物質如有機磷化合物或氨基甲酸酯類殺蟲劑及藥物能阻止乙酰膽堿水解，造成乙酰膽堿堆積，從而引起神經系統過度活躍。人類和其他動物若接觸膽堿酯酶抑制物質，取決于其類型和數量，可造成從輕度如抽搐、顫抖等到嚴重如呼吸麻痹、驚厥等癥狀。在極端情況下，引起死亡。

膽堿酯酶可由不同數量的催化和非催化亞基組成。這兩種酶都由約600個氨基酸的亞單位組成并糖基化。根據其底物偏好和對選擇性抑制劑的敏感性，膽堿酯酶分為兩大類。

那些優先水解乙酰膽堿酯類如乙酰膽堿的酶，其酶活性對化學抑制劑BW284C51敏感，被稱為乙酰膽堿酯酶(AChE)，或乙酰膽堿乙酰水解酶(EC3.1.1.7)。乙酰膽堿酯酶又稱真實型，特異型，純正型，紅細胞型，或I型膽堿酯酶，是一種膜結合糖蛋白，并以不同分子形式存在于紅細胞、神經末梢、肺、脾和大腦灰質。乙酰膽堿酯酶在體內主要用于水解乙酰膽堿。

那些優先水解其他類酯如丁酰膽堿的酶，其酶活性對化學抑制劑四異丙酯焦磷酰胺(ISO-OMPA)敏感，被稱為丁酰膽堿酯酶(BCHE，EC3.1.1.8)。丁酰膽堿酯酶也被稱為假性丁酰膽堿酯酶或非特異丁酰膽堿酯酶。丁酰膽堿酯酶根據其電荷，疏水性，與細胞膜或細胞外結構互動，及亞基組成而進一步分類。該酶又稱血漿型，血清型，苯甲酰型，虛假型或II型膽堿酯酶，有超過11個同工酶變異體。丁酰膽堿酯酶優先使用丁酰膽堿和苯甲酰膽堿作為其體外反應底物。該酶存在于哺乳動物血漿、肝、胰、腸粘膜、中樞神經系統白質、平滑肌和心臟。丁酰膽堿酯酶的具體功能尚不明晰，它沒有已知的特定自然底物，雖然它也水解乙酰膽堿。

盡管膽堿酯酶抑制物質對人體產生破壞性影響，但它們也有治療用途，能治療老年癡呆癥和帕金森氏病，青光眼，多發性硬化癥，重癥肌無力等。

有機磷化合物在過去50年中應用于戰爭及作為農藥使用使急性和遲發性中毒病例數目持續上升。據估計，每年50-100萬農藥相關的中毒病例中，死亡人數達19,000人。據統計，2007年中國農藥總產量達173萬噸，居世界第一位(農藥研究與應用2008年第2期)。但是，中國研發的高效、低毒、低殘留、環保型農藥所占比例較低，殺蟲劑在各類農藥中所占比重較高，且50%以上是廣譜、高毒有機磷殺蟲劑。農藥大量應用具有較大風險，如由于施用技術不當，環境健康意識不強，過多使用或管理不善而引起的人體急性有機磷農藥中毒和農產品農藥殘留問題，不僅威脅人類健康，還影響到農產品在國際市場的競爭力。