[發明專利]利用轉基因動物乳腺生物平臺大規模生產重組人丁酰膽堿酯酶的方法

有效

• 申請號: 201210583474.4
• 申請日: 2012-12-27
• 公開（公告）號: CN103898101B
• 公開（公告）日: 2017-08-08
• 發明（設計）人: 黃躍進
• 申請（專利權）人: 上海桀蒙生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/63;C12N5/10;C12N9/18;A61K38/46;A61P39/02;A61P11/00;A01K67/027
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司31266
• 代理人: 祝蓮君,雷芳

1.一種表達盒，其特征在于，所述表達盒從5'至3'，依次包括可操作性連接的以下元件：

(i)絕緣體片段；

(ii)酪蛋白啟動子或乳清酸性蛋白質啟動子序列；

(iii)至少一個信號肽編碼序列，所述信號肽編碼序列提供表達丁酰膽堿酯酶單體，或丁酰膽堿酯酶單體-白蛋白融合蛋白分泌的信號肽；

(iv)重組蛋白編碼序列，所述編碼序列編碼丁酰膽堿酯酶單體，或丁酰膽堿酯酶單體-白蛋白融合蛋白，其中所述丁酰膽堿酯酶單體為不形成四聚體的截斷型單體，并且所述的丁酰膽堿酯酶或其融合蛋白選自下組：(a)氨基酸序列如SEQ ID No.:2所示的重組人丁酰膽堿酯酶單體；(b)氨基酸序列如SEQ ID No.:3所示的重組人丁酰膽堿酯酶單體-白蛋白融合蛋白；和

(v)終止密碼子；

并且，當所述表達盒整合入哺乳動物細胞后，經核移植使轉基因哺乳動物乳腺表達并分泌丁酰膽堿酯酶單體，或丁酰膽堿酯酶單體-白蛋白融合蛋白。

2.如權利要求1所述的表達盒，其特征在于，所述的信號肽編碼序列為酪蛋白信號序列。

3.如權利要求1所述的表達盒，其特征在于，所述的重組蛋白編碼序列選自下組：

(i)核苷酸序列如SEQ ID No.:5所示的重組人丁酰膽堿酯酶單體編碼DNA序列；

(ii)核苷酸序列如SEQ ID No.:6所示的重組人丁酰膽堿酯酶單體-白蛋白融合蛋白編碼DNA序列。

4.一種載體，其特征在于，所述的載體含有權利要求1所述表達盒。

5.一種宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞中含有權利要求4所述的載體或染色體中整合有權利要求1所述表達盒，其中所述的宿主細胞為非人哺乳動物細胞，且選自下組：乳腺上皮細胞或胚胎成纖維細胞。

6.一種制備丁酰膽堿酯酶單體，或丁酰膽堿酯酶單體-白蛋白融合蛋白的方法，其特征在于，其中所述單體為不形成四聚體的截斷型單體，并且所述方法包括步驟：

(i)提供一轉基因的非人哺乳動物動物，所述轉基因非人哺乳動物的染色體中含有權利要求1所述表達盒，從而在泌乳期分泌含丁酰膽堿酯酶單體，或丁酰膽堿酯酶單體-白蛋白融合蛋白的乳汁；和

(ii)從所述乳汁中分離所述的丁酰膽堿酯酶單體，或丁酰膽堿酯酶單體-白蛋白融合蛋白。

7.一種制備轉基因非人哺乳動物的方法，其特征在于，包括步驟；

(i)提供一含有權利要求1所述表達盒的載體或來自所述載體的含權利要求1所述表達盒的核酸片段；

(ii)將上一步驟所述的載體或所述的核酸片段轉入非人哺乳動物的細胞，獲得經轉染的細胞；

(iii)從上一步驟的經轉染的細胞中，選出染色體中整合有權利要求1所述表達盒的細胞，從而獲得整合的細胞；

(iv)將來自所述整合的細胞的細胞核轉入去核卵母細胞，從而形成融合細胞；

(v)將上一步驟的融合細胞或衍生自所述融合細胞的胚胎轉入雌性哺乳動物代孕體，從而導致該代孕母體分娩出轉基因的非人哺乳動物；

其中，所述的細胞、卵母細胞和雌性哺乳動物屬于同一物種。